浮游植物样品的前处理优化及计数方法研究

路晓锋，林青*，韦雪柠，邓雷，贺莹，练海贤

（1.广东粤港供水有限公司，广东 深圳 518021；2.广东粤海水务股份有限公司，广东 深圳 518021）

1 引言

浮游植物是水质的重要指示参数，也是水生态和水环境评价的重要内容，浮游植物的群落结构会随着水体环境的改变而快速改变[1]，因而可根据浮游植物的种类与数量的变化反映出水体环境的变化[2、3]。目前，浮游植物的计数方法主要包括人工计数和仪器分析，由于仪器分析技术尚不完全成熟，故而人工计数仍然是现阶段浮游植物计数的主流方法。

浮游植物计数前需要进行前处理固定，这是浮游植物监测过程中重要的步骤，直接影响浮游植物计数的准确度和精密度。目前，浮游植物检测的前处理方法包括自然沉淀法[4、5]、超声振荡法[6]、离心沉淀法[7]等。自然沉淀法主要包括正置显微镜自然沉淀法与倒置显微镜自然沉淀法，其中，正置显微镜自然沉淀法无需使用专门的设备仪器即可完成操作，但存在浮游植物固定时间长，虹吸过程存在误差的缺点[8]；倒置显微镜自然沉淀法能在缩短浮游植物固定时间的同时，还能有效降低固定操作带来的浮游植物生物量损失[9～12]。超声振荡法利用滤膜抽滤水样使浮游植物富集于膜上，再利用超声装置收集滤膜上脱落的浮游植物，超声振荡法能快速实现浮游植物的前处理操作，但存在超声过程中对浮游植物的破坏而影响计数结果。离心沉淀法利用离心作用使浮游植物快速沉降，然后通过收集沉淀部分作为待测液，离心沉淀法能快速实现浮游植物的沉降处理，但在样品离心前的分批转移以及沉降不完全容易造成浮游植物损失。

本研究对自然沉淀法、超声振荡法和离心沉淀法进行前处理时间优化，然后在优化条件下，分别使用正置显微镜法和倒置显微镜法应用于实际水样浮游植物的检测，考察对比了每种方法检测出的浮游植物种属、丰度及对应的精密度，通过综合分析确定最优的浮游植物检测方法。

2 材料与方法

2.1 主要仪器和试剂

仪器：正置显微镜Olympus BX53；倒置显微镜Nikon TS100F；沉降器、超声波清洗机VGT-1024F、离心机80-1、真空泵GM-1.0A；计数框0.1mL（20mm×20mm）；盖玻片（22mm×22mm）；量筒1L；虹吸管；洗耳球；移液管10mL；移液枪1mL；离心管50mL；容量瓶50mL；尼龙滤膜：直径50mm、孔径0.45μm。

试剂：鲁哥氏液，40g碘溶于含碘化钾60g的1000mL水溶液中；脱色液，10g硫代硫酸钠溶于100mL水溶液中。

2.2 浮游植物固定与计数

2.2.1 正置显微镜自然沉淀法

（1）样品采集：采水样1L，取水体表层下0.5m处的水样。

（2）样品固定：水样移至1L的量筒内，加入15mL的鲁哥氏液固定，摇匀，避光室温保存。

（3）沉淀浓缩：自然沉淀一定时间后，用虹吸管抽掉上清液，余下约30mL沉淀物转入50mL容量瓶中，为减少样本的损失，再用上清液少许冲洗量筒几次，冲洗液加入到容量瓶中，最后定容。

（4）浮游植物计数：将浓缩定容后的样品充分摇匀，使用0.1mL吸管吸出0.1mL的样品注入计数框，盖好盖玻片使样品分布均匀，在10×40倍显微镜下计数，所得结果按下式换算成每毫升水中浮游植物的数量：

式中：

N—每毫升水中浮游植物的数量，个/mL；

A—计数框面积，400mm2;

Ac—计数面积，视野面积×视野数；

Vw—1L水样经沉淀浓缩后的样品体积，50mL；

V—计数框体积，0.1mL；

n—计数所得浮游植物的个体数，个细胞。

2.2.2 倒置显微镜自然沉淀法

（1）样品采集：用采水器采集原水装入500mL体积的采样瓶，立即添加鲁哥氏液2.5mL。

（2）计数样品制备步骤：1）将10mL水样摇匀后注入沉降管中；2）盖好盖玻片静置且不能有气泡，静置一定时间；3）加入浓度10%的硫代硫酸钠0.5mL进行脱色；4）将沉淀好的水样的上清液移入废液框；5）盖好底座盖玻片，不能有气泡；6）于倒置显微镜上鉴定和计数。

（3）浮游植物计数：于10×40倍显微镜下计数，所得结果按下式换算成每毫升水中浮游植物的数量：

式中：

N—原水藻丰度，个/mL；

V—沉降柱体积，mL；

D—载玻片直径，mm；

d—计数镜头直径，mm；

n—计数镜头数 ；

C—计数细胞数，个细胞。

2.2.3 超声振荡法

（1） 样品采集：同2.2.1的（1）。

（2）计数样品制备步骤：1）将1L水样取出49mL，对剩余水样经抽滤装置进行过滤；2）将滤水后的滤膜取出，放入盛有49mL水样的烧杯中，将其放入超声波振荡器振荡；3）将振荡后的滤膜除去，将浓缩后的水样定容至50mL。

（3）浮游植物计数：方法同2.2.1的（4）。

2.2.4 离心沉淀法

（1）样品采集：同2.2.1的（1）。

（2）计数样品制备步骤：将样品用50mL的离心管在3000r/min的转速下采用分批离心的方法进行浓缩，每批次沉淀物约为2.5mL，合并所得的沉淀物用上清液定容至50mL，混匀后计数。

（3）浮游植物计数：方法同2.2.1的（4）

2.3 数据分析

取3个点位（1#、2#、3#）的源水在显微镜400倍放大下进行浮游植物观测，每个源水点位重复测定2次，按浮游植物细胞数进行计数，根据浮游植物的形态特征进行鉴别分类计数[13、14]。

3 结果

3.1 正置显微镜自然沉淀法浮游植物固定时间优化

取1#、2#、3#不同点位的水样1000mL，选取6、12、18、24、30h进行浮游植物固定时间优化，如图1所示。结果表明，固定时间从6h增至18h，浮游植物丰度逐渐增加；当固定时间继续增加至30h，浮游植物丰度基本达到平衡。因此，正置显微镜自然沉淀法浮游植物固定时间为18h。

图1 正置显微镜自然沉淀法浮游植物固定时间优化结果

3.2 倒置显微镜自然沉淀法浮游植物固定时间优化

取1#、2#、3#不同点位的水样10mL，选取1、2、3、4、5、6、7、8h进行浮游植物固定时间优化，如图2所示。结果表明，固定时间从1h增至5h，浮游植物丰度不断增加；当固定时间继续增加至8h，浮游植物丰度基本达到平衡。因此，倒置显微镜自然沉淀法浮游植物固定时间为5h，在保证实验准确度的同时，可以有效缩短固定时间，提高检测效率。

图2 倒置显微镜自然沉淀浮游植物固定时间优化结果

3.3 超声振荡法振荡时间优化

取1#、2#、3#不同点位的水样1000mL过滤后，在功率100W超声功率下，选取5、10、15、20、25min进行超声震荡时间优化，如图3所示。结果表明，当超声震荡时间小于15min时，随着超声震荡时间的增加，从滤膜上脱落的浮游植物数量也会相应增加，所以检测到的浮游植物丰度逐渐增加；当超声震荡时间大于15min时，检测到浮游植物丰度基本达到平衡，这表明最优的超声振荡时间为15min。

图3 超声振荡时间优化结果

3.4 离心沉淀法离心时间优化

取1#、2#、3#不同点位的水样1000mL，在3000r/min的转速下分批离心浓缩。选取5、10、15、20、25min进行离心时间优化，如图4所示。结果表明，当离心时间小于15min时，随着离心时间的增加，悬浮的浮游植物沉降到离心管底部的数量会相应增加，所以检测到的浮游植物丰度逐渐增加；当离心时间大于15min时，检测到浮游植物丰度基本达到平衡，这表明最优的离心时间为15min。

图4 离心时间优化结果

3.5 应用研究

3.5.1 实际水样的浮游植物种类和总数研究

在优化的条件下，将正置显微镜自然沉淀法、倒置显微镜自然沉淀法、超声振荡法和离心沉淀法应用于3种实际水样（水样A#、水样B#和水样C#）浮游植物的检测，通过检测到的浮游植物种类和数量来计算不同方法的准确度。4种方法的汇总对比结果见下表。从结果分析，倒置显微镜自然沉淀法观测的浮游植物种类与总数均比其它3种方法要高，总体上超声振荡法仅次于倒置显微镜自然沉淀法的观测效果，正置显微镜自然沉淀法次之，离心沉淀法观测到的浮游植物数与种类较少。

3.5.2 浮游植物精密度分析

在优化的条件下，将正置显微镜自然沉淀法、倒置显微镜自然沉淀法、超声振荡法和离心沉淀法应用于3种实际水样浮游植物的检测，通过检测6个平行样本来考察不同方法的精密度。对比结果见图5，结果表明，倒置显微镜自然沉淀法相比后3种方法取用的样品水量较少，且数据具有较好的精密度，反映出倒置显微镜自然沉淀法检测结果较为稳定，相对偏差小。因此，倒置显微镜自然沉淀法具有精密度好的优势。

四种浮游植物方法不同点位检测结果比较表（P＜0.05）

图5 水样A#、B#、C#不同前处理方法精密度分析图

4 讨论

由图1～图4浮游植物检测的前处理时间优化结果可知，综合考虑时间长度和结果准确性精密度，4种方法的前处理时间分别采用不同时间段处理后选用最优的时间作为优化后的固定时间，正置显微镜自然沉淀法固定时间为18h，倒置显微镜自然沉淀法固定时间为5h，超声振荡法振荡时间为15min，离心沉淀法离心时间为15min。从前处理时间分析倒置显微镜自然沉淀法、超声振荡法、离心沉淀法均能较好地满足浮游植物的快速检测需求。

对4种前处理方法的优劣进行比较，自然沉淀法是利用浮游植物的自然沉降达到浮游植物富集的目的[15～17]，正置显微镜自然沉淀法需要耗时18h，过长的前处理时间会影响结果的准确性[18]。同时在虹吸的操作过程中轻微的振荡会造成水体中部分浮游植物的悬浮，抽吸上清液时会把这部分浮游植物去除造成实验数据平行性较差，导致实验误差[19、20]。

超声振荡法操作时间短，但存在较大的误差，当水样中的浮游植物或杂质较多滤膜难以清洗干净时，可能造成浮游植物数量损失，同时对于群体浮游植物，如平裂藻、栅藻、微囊藻、假鱼腥藻、鱼腥藻等，在超声过程中会被打散成单个细胞，造成浮游植物数量的不稳定。而且过大的超声功率作用下，部分浮游植物细胞可能会破裂碎片化[6]，影响计数结果。

离心沉淀法能快速缩短浮游植物沉降时间，但在分批转移离心样品时容易造成浮游植物的损失，同时密度较小的浮游植物在转移过程和离心后容易上浮，导致浮游植物平行计数结果不稳定。

相比正置显微镜自然沉淀法，采用倒置显微镜自然沉淀法不仅可以把固定时间缩短为5h，而且避免了虹吸操作造成的浮游植物损失，直接一步沉淀到位，可省略正置显微镜自然沉淀法中的中间操作环节。相比超声振荡法和离心沉淀法，虽然倒置显微镜自然沉淀法前处理时间比超声振荡法和离心沉淀法要长，但其计数的准确性和精密度均比超声振荡法和离心沉淀法要好。

倒置显微镜自然沉淀法采用的沉淀板计数框体积约为3mL，比正置显微镜自然沉淀法、超声振荡法和离心沉淀法的计数框体积要大0.1mL，能使分类计数和鉴定的结果更为全面，这与上表的结果是一致的。此外，倒置显微镜自然沉淀法操作过程较简便，无需通过多次冲刷转移固定后的水样，只需通过沉淀杯将水样一步沉降到位，可有效提高准确度。

由图5对4种方法的精密度比较可知，总体上倒置显微镜自然沉淀法相比于正置显微镜自然沉淀法、超声振荡法、离心沉淀法具有检测用的水量少且精密度较好的优势，分别对不同点位的平行检测结果显示，倒置显微镜自然沉淀法检测数据具有较高稳定性。

综上分析，倒置显微镜自然沉淀法比正置显微镜自然沉淀法具有操作耗时短、操作简便的优势，比超声振荡法和离心沉淀法的准确性和精密度均较好。因此，固定时间5h的倒置显微镜自然沉淀法满足浮游植物精准检测分析要求。