高通量测序技术在食源性病原体快速检测中的应用进展

付博菲，朱晓龙，邱斌

（1.天津师范大学，天津300387；2.天津医科大学，天津300070；3.山东省农业科学院农产品研究所，山东省农产品精深加工技术重点实验室，农业部新食品资源加工重点实验室，山东济南250100）

近20年来，随着食源性疾病发生率明显升高，其 已成为严重危害公众健康的全球性问题[1]。其中，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全最重要的因素之一[2]，在我国食物中毒事件中，沙门氏菌、副溶血性弧菌等微生物性食物中毒事件最多。这些直接（感染性抗原）或间接（代谢产物，如细菌毒素、真菌毒素）造成食源性疾病（foodborne diseases，FBDs）的微生物则称之为食源性病原体（foodbornepathogens，FBPs）[3-4]。常见的FBPs包括细菌、病毒、寄生虫和部分真菌。无论是在发达国家还是发展中国家，FBPs都可能对食品安全及公众健康带来严重威胁[5-7]。

食源性病原体引发食物中毒爆发后的调查、确诊、控制、监测，均需要病原微生物分析，目前常用的方法有传统的培养以及分子生物学、免疫学方法，如聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。传统的培养需要大量时间和人力通过富集、分离以获取纯种病原体，ELISA技术敏感性低、易出现假阳性且操作前需富集等缺点[8]，PCR技术虽然精度高、速度快，但花费高，且通量低致使操作繁琐重复[9]，高通量测序技术（high throughput sequencing，HTS）由于其通量大正在逐步应用于FBPs的检测。

高通量测序技术可以快速获取被检测样本成千上万的基因序列或者是数以亿计的碱基对信息。读取的序列长度、错读率及读取数目变化大，并可根据实际选用选择性、非选择性、随机性等模式。其数据库涵盖了绝大多数的致病微生物的高质量基因组，且数目仍在快速增长。即使在遇到无法识别的基因组时，也可在半自动化的de novo测序及基因重组技术的辅助下实现鉴别[10]。目前，包含上千个完整序列基因组的数据库已投入使用，使常见的乃至是罕见的病原微生物的鉴别变得更加迅速。通常来说，低错读率，长读取，高覆盖率有利于序列重组。但在实际应用中，应根据目的基因组的读取长度、数目、错读率及花费来综合衡量，选取合适的HTS平台。

1 基于HTS的食源性微生物分析

高通量测序技术由于其无需培养、灵敏度高、检测速度快等优点逐步成为食品检测的常规途径。其主要操作流程包括提取样品中微生物总DNA或RNA、引物设计及PCR扩增、基因组测序及基于数据库的生物信息学分析。根据是否检测样品全部基因组分为全基因测序（whole genome sequencing，WGS）及靶基因组测序。Marchesi等将靶基因组测序，即对多种RNA编码性DNA或其他标志性DNA进行选择性扩增分析称之为“Metataxonomics”[11]。全基因组测序可检测样品中的全部DNA序列。基于全基因组的或全转录的RNA测序则统称为RNA测序。全基因组测序具有误差小、无需预知特异性标志基因组及可用来检测微生物基因组组成变化等优点，但花费高、数据复杂且量大，相对来说Metataxonomics则具有敏感度高，费用少，但在检测相似菌种的时候难以区分。因此在应用HTS时应根据具体目的选择合适的模式。

目前应用较广泛的HTS测序技术有Illuminag公司的Solexa测序技术、Roche公司的454焦磷酸技术、ABI公司的SOLID序技术及Pacific Biosciences公司的SMRT技术。Solexa测序是目前流行的HTS技术，其利用“DNA簇”技术可在DNA片段合成同时测序，并将脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）可逆性终止技术与荧光标记技术相结合，应用相应的激光捕获装置获取在激光激发条件下样本的荧光信号，确保实时、准确的检测基因序列组成，该技术具有保真度最高，测序周期短，具有GA、Hiseq、Miseq、NextSeq 等多系列测序仪器。454焦磷酸技术测序起始时T、A、C、G 4种碱基依次进入含有多种诱发焦磷酸发生反光反应所必需的酶及底物的显微滴定板（pico titer plate，PTP）中，当发生碱基配对后，释放出的焦磷酸则会发生一系列反应，释放出可经电荷耦合器件（charge coupled device，CCD）捕捉的光信号。相对Sanger法测序速度、准确性及样本量均大大提高，但由于产生同聚物而存在误差，其错读率则相对较高[12]，多用于宏基因组测序。ABI SOLID测序技术则是直接以4色荧光标记的4种碱基，基于碱基互补配对后比较分析颜色编码序列。其突出特点为每个碱基可被检测2次，提高读取序列结果的准确性，且相关磁珠编码系统相对完善，适用于检验单核苷酸多态性[13]，在实验或食品微生物检测应用中潜力巨大。而（switching mechanism at 5′end of the RNA tran，SMRT）技术由于其具有单分子实时测序功能，且读取基因组长度明显高于第二代测序技术[14]，其突出优点为样品需要量小，读取速度快，提供信息量较第二代测序技术大，可检测到如甲基化等碱基修饰改变，多用于完全性封闭基因组、长链重复性序列、质粒及噬菌体的重组。

在食源性微生物的研究中，HTS有助于全面了解食品中微生物群落、动态和生理活性，CJ Doyle等人利用HTS通过检测微生物变化反映原生乳的泌乳阶段及保存条件[15]，其所需时间仅为 2 d～3 d，此外，HTS还可检测乳制品中微生物的多样性[16]，由此可见HTS可快速检测食品质量、保证食品安全。

2 HTS在食源性病原体检测中的应用

2.1 细菌性食源性病原体

细菌性FBPs在食品中具有含量少、传播快的特点。因此具有检测多种食物来源的超低水平的FBP能力至关重要。目前常用的检测方法是富集、提纯然后应用PCR技术检测。但从食物中分离致病菌十分困难。食品中最为普遍的细菌性病原体为沙门氏菌、李斯特菌和产毒性大肠杆菌，这3种细菌常诱发危及生命或严重的食源性疾病[17-18]，因此在食品检测或食源性疾病致病菌诊断中，以这3种细菌为主。

WGS可通过单核苷酸分析或扩增性多位点序列分型对菌群亚型实现精确分类，并可协助毒性及抗生素抗性基因等组分的鉴别[19-21]。Underwood等选取一项早期STEC O157：H7爆发研究中患者及动物的提取物利用WGS进行比较及致病菌鉴别，根据测序结果将其分为5个亚型。后将这些数据应用于跟踪疫情，在对疫区其他106份提取物的检测中发现，证明这5种亚型致病菌在感染人类前广泛地分布在该农场区域[22]。这提示WGS对于食源性疾病的流行监控及致病菌追踪具有重要意义。Gilmour等则运用该技术成功鉴别2008年加拿大的食源性疾病爆发的致病菌为李斯特菌[23]。近年来在芯片技术的辅助下，高通量测序有了进一步发展。郭启新等则运用高通量技术及液相芯片技术建立了检测金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌的方法，具有高特异性及高灵敏度[24]。Sun等建立的高通量悬浮阵列可同时检测6种食源性致病菌，且灵敏度高达20.4×103CFU/mL[25]，这提示应用HTS进行多样品多菌种的同时检测将逐步成为现实。

但在多数情况下，食物中聚集含量很低，获得目标病原菌的提取物十分困难。病原体通常是分散的且在复杂的食物微生物群落中占比很少。因此，通过对目的基因及其他多种序列保守的标志物进行检测分析的Metataxonomics技术则为无法选择性提取的微生物（包括无法培养和可培养但无法传代的微生物）检测提供了可能。在对2011年德国STEC O104：H4的回顾性研究中已证实Metataxonomics也可应用于食源性疾病爆发后病原体的鉴别[26]，经对比后发现65%的基因与大肠杆菌相关。在对其他样本检测中还鉴别出弯曲杆菌、沙门氏菌和梭状芽胞杆菌等人类致病菌。Metataxonomics同时也应用于食品监测，如沙门氏菌污染的番茄已造成多次食源性疾病爆发，但从番茄中提取沙门氏菌只成功了几次，Ottesen等利用MiSeq DNA测序及Metataxonomics技术成功从番茄样本中鉴别出沙门氏菌[27]。后来测序与Metataxonomics相结合的方法逐步应用于冰淇淋中李斯特菌、菠菜中大肠杆菌的检测[28-29]。FF De等则利用454平台检测奶酪制品中的嗜热链球菌lacS基因，发现不同样品中含有28种lacS基因型[30]，为将非rRNA基因标志应用于细菌定量检测提供了先例。芬兰学者M Andreevskaya运用SOLID测序技术对鱼乳球菌Lactococcus piscium MKFS47进行全基因组测序，发现其腐败功能与异常的丙酮酸代谢途径相关，同时发现该菌的特有基因，为以后该菌的检测提供了特异性识别基因[31]。此外，由于HTS的高通量特性，也常用来分析食品中微生物群落的变化情况，对于抑制食品中有害微生物滋生、延长食品保质期提供参考。Ercolini D等通过对存储在空气、真空和抗菌包装中的牛肉在保存过程中微生物群落结构及代谢物进行全程监测，发现不同条件下致腐微生物的差异，从而提出既有针对性的牛肉的保鲜建议[32]。HTS无需培养、直接、快速检测的优点推动了其在食品微生物的监控中的应用，而简化快捷的检测方法的应用间接促进了国际食品贸易的发展。

由此可见，HTS技术无论是在调查爆发性食源性疾病致病菌还是在易污染食品的易感菌的检测上都有着巨大潜力。目前，大多数的食源性致病菌甚至是非致病的基因组数据库均已建立，并且细菌分类相关的特异性基因组数据也在快速增加，促进HTS可分析鉴别的致病菌种类大幅增长，HTS将越来越普遍的应用于食源性致病菌的鉴别、食品快速检测及疾病控制中。

2.2 病毒性食源性病原体

病毒性FBP基因组相对于细菌性FBP简单，缺少编码转录蛋白的DNA以及复制、繁殖相关基因，且具有高度多样化，没有如同细菌中核糖体RNA的共有基因结构[33]。病毒性FBP在FBD中具有双重作用，一方面可以影响食品中细菌的毒性及群落构成，另一方面可直接诱发FBD[34-35]。由于正常的烹饪即可消灭病毒，所以引起病毒感染的食物通常是新鲜的农产品，如软浆果，草本植物，贝类，即食产品或其他生食。常见的FBP病毒有诺如病毒、甲型肝炎病毒（Hepatitis A virus，HAV）、乙型肝炎病毒、单链RNA病毒及轮状病毒。由于病毒性FBP除通过食物传播外，还可通过人与人之间传播，更易诱发集中性大规模爆发。甲型肝炎常爆发于卫生条件好且无广泛接种疫苗的地区，如最近的报道的欧洲HAV疫情，造成1 589人感染，2人死亡[36]。我国突发公共卫生事件评估显示诺如病毒为病毒性腹泻主要致病原[37]，在北京地区对市售牡蛎轮状病毒的检测，发现有引发食源性疾病的潜在风险[38]。这提示我们即使在卫生条件良好的城市也不可放松对食源性疾病的重视。及时监测及发现销售食品中的病毒性FBP对于防范FBD、维护食品安全、保障公众健康具有重要意义。

尽管部分病毒可培养，但其设备要求高、花费多且耗时长，所以目前常用的检测方法中无需培养。HTS则为食源性病毒检测提供了快速便捷且可靠的方法。由于食品中病毒含量低，所以提取物样品多取自临床患者，如粪便。在一项美国流行病学研究中，则发现甲型肝炎爆发的病因是进口冷冻石榴子受到HAV污染[39]。而Mizukoshi等成功应用MiSeq RNA测序诊断出2012年日本青少年胃肠炎爆发的病原体是G1P[8]型轮状病毒[40]，但在后来的调查中，未发现食物媒介。张静娜等则利用Hiseq 2500对丙型肝炎病毒病毒（hepatitis C virus，HCV）Core/E基因高变区进行测序比较，对共用针具感染乙肝病毒的患者进行溯源调查[41]，这提示HTS应用在追踪食源性感染源头上具有可行性。HTS也可应用于检测食品中的病毒，诺如病毒具有极强的传染性，常造成大规模的胃肠炎流行，致使其成为世界范围内腹泻相关疾患的主要原因[42]，也成为美国食源性疾病的主要病因[43]。Imamura等应用HiSeq测序仪的RNAseq技术及MiSeq系统对衣壳蛋白VP1基因进行分型，检测并分析海岸贝类所感染诺如病毒的基因型差异[44]，AW等建立了应用HiSeq鉴别生菜中人畜共患疾病病毒的方法[45]，Fernandez-Cassi等则应用MiSeqRNAseq技术对经污染的水灌溉的荷兰芹进行病毒分析鉴别[46]。我国学者郑乾明通过提取可疑感染病毒的火龙果枝条总RNA并合成cDNA，应用IlluminaHiseq 4000进行测序，成功分析火龙果感染的病毒种类[47]。

病毒性食源性疾病的病原体常无法确诊，一方面是由于病毒含量低，检测技术的敏感度低，另一方面则是病毒变异多，易出现新型病毒，缺少新病毒相关的基因组数据库。但是随着提取、数据分析等相关技术的完善，以及运用de novo重组技术迅速建立新型病毒的基因组数据库，HTS检测技术逐步完善。目前HTS多用于临床病毒检测乃至病毒性疾病跨国传播的防控中，我国已成功应用HTS于入境人员相关病毒疾病的检测[48]。同时，HTS加速了病毒遗传学、病毒基因组学和病毒相关的分子流行病学，病毒的变异及种特征、疫苗无效的分析乃至病毒药物抗性的分析几乎完全依赖于HTS。尽管HTS很少用于病毒性食源性病原体的鉴别，但可以预见的是HTS在该领域有着巨大应用价值[49]。

2.3 真菌性及寄生虫性食源性病原体

目前HTS应用于真菌性FBP检测的案例很少，经报道的食源性真菌感染则更为稀少[50]。代表性的案例为Lee S等从引起爆发性食源性疾病的酸奶中发现卷枝毛霉菌基因组，并确定其为具有高毒性的M.circinelloides f.circinelloides亚型[51]。此外Billmyre等运用Hiseq 2500行全基因组测序，追踪高重组VGII型隐球菌的流行及变异，发现该类隐球菌可通过有性及无性繁殖实现基因组不同幅度的进化，从而增强感染性及毒性[52]，Sophie Vaux运用IlluminaHiSeq 2000对来自于多个患者的不同真菌系进行测序，后利用Phylogenetic analysis分析比较检测所得的高质量单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），成功利用WGS与clone-specific genotyping技术发现了新的机会性致病真菌[53]。截止至2017年8月，NCBI公布的真菌相关基因序列只有2 515个，完整的真菌基因组仅为29个，且真菌多为机会性致病菌，患者多免疫力低下，一定程度上限制了HTS在真菌检测的应用。寄生虫则是一类体积较小的动物或真核生物，多可使用显微镜及PCR确诊，几乎不适用HTS，目前仅有一篇相关发表文献，在对比目鱼相关的食源性疾病的病原调查中，从鱼肉中发现可疑孢子，推测可能是寄生虫感染，Kawai等应用GAIIRNAseq技术并辅以Sanger DNA测序技术发现粘孢子虫（Kudoaseptempunctata）的18S rDNA，结合后续的动物感染实验，明确Kudoaseptempunctata为该次爆发食源性疾病的罪魁祸首[54]。

3 HTS的优势及缺陷

高通量测序技术相对于其他技术具有无需培养、可快速准确的获取样品（食物或其他载体）中多数微生物的高级别基因信息，并可以同时分析单个或多个样品中的多种微生物区系，且其操作已实现自动化或半自动化，极大地节省了人力和物力，理想的HTS技术应该是快速、准确、可操作性强且花费低。但目前仍存在不足，例如由于HTS的平台少及后续分析数据复杂且量大及样本收集、预处理，造成测序花费少，整体花费高。且由于测序获得信息多，其处理需要高效强大的计算能力，这对于数据存储、管理、质量控制、绘制图谱及宏基因组学，乃至是生物信息学均有着极高的要求[55]。同时HTS测序平台对于基因组数据库的访问权限限制，其高额的访问费用加剧了HTS进一步应用与推广的障碍。

4 展望

近年来，HTS被广泛应用于食品微生物研究中，在食源性病原体的检测中也逐步推广。不可否认的是目前HTS数据库仍缺少很多病原体基因组信息，特别是病原体本身高频率的变异及新病毒、细菌种类的出现，致使可鉴别的病原体种类占比更小。但随着测序技术的推广，病原体基因组信息不断完善，新鉴别基因位点不断被发现，可充分满足多数FBP鉴别检测要求。此外，也应改进生物信息学的存储、分析、比较方式，提出更高速的计算方法，并开放基因组信息的数据库访问权限，拓宽HTS获取渠道。未来HTS将与纳米检测技术等新兴方法相联合，进一步简化操作程序，提高检测特异性、敏感性，并降低花费，使HTS不仅用于食源性病原体的检测鉴别，还将具有探究抑制食源性病原体滋生、食品保鲜、病原体群落间作用及其他更为广泛的应用。