细胞焦亡与糖尿病肾病炎症关系研究进展*

范增慧，马锋锋，屈 杰,2，李小会,2Δ

1. 陕西中医药大学(咸阳712046)； 2.陕西省中医药管理局 伤寒学与经方辨治疑难病重点研究室(咸阳 712046)

21世纪初，一种被称为细胞焦亡的细胞死亡新方式在被沙门杆菌感染的巨噬细胞中被发现[1]。研究[2]表明，细胞焦亡是一种病原诱导的、依赖炎性胱天蛋白酶1/4/5/11(cysteine-dependent aspartrate-specific proteases，Caspase-1/4/5/11)并伴随炎症反应的细胞程序性死亡方式。炎性小体激活并活化下游底物天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,caspase-1)介导后续Gasdermin D(GSDMD)蛋白裂解是细胞焦亡的关键。已有研究[3]表明NOD样受体家族3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptors,NLRP3)、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)及活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)可通过半胱天冬酶(caspases)诱发细胞焦亡。而GSDMD蛋白是所有炎性caspases的共有底物，可独立介导白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)等炎症介质的释放。炎性caspases在特定位点通过裂解GSDMD，激活其打孔活性是焦亡细胞胞膜破裂、细胞崩解的效应机制。免疫炎症性疾病糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)由多种炎症因子介导，炎症反应是其肾脏慢性损伤的重要因素。炎症反应贯穿细胞焦亡和DN全程，作为二者的中介，我们可从炎症反应角度实验探讨DN与细胞焦亡的联系与发生机制。细胞焦亡可通过外源性感染和内源性损伤信号诱导自发炎症性疾病DN炎症反应的发生，但研究尚处于起步阶段。本综述从炎症小体激活caspase-1诱发炎症介导细胞焦亡机制及GSDMD蛋白打孔的效应机制角度阐述细胞焦亡在DN中的研究进展。

1 细胞焦亡与凋亡

细胞焦亡具有的细胞核浓缩、染色体DNA降解等形态学特征和依赖Caspases激活的机制使其在研究初期易与凋亡混淆，但在生物学特征及分子机制上仍可与凋亡相鉴别。凋亡发生时伴随的细胞皱缩、核固缩、凋亡小体形成一系列特征均不会破坏胞膜及细胞器。因此完整结构的细胞胞质无法外流，局部常无炎症反应。细胞焦亡区别于凋亡最显著的特征是胞膜完整性破坏而后诱发的一系列炎症反应。一方面细胞焦亡时由于胞质膨胀，胞膜受力不均，破裂形成1～2 nm的小孔隙，最终导致细胞内容物外流，大量促炎因子释放诱发炎症反应，细胞染料可由胞膜破损形成的小孔使细胞核着色，这一特征常可通过核DNA染色阳性来识别；另一方面细胞焦亡伴随Caspase-1/4/5/11的激活并释放IL-1β、IL-18,募集更多的炎症细胞，扩大局部和全身炎症反应。体内外多种刺激信号使炎性小体发生应答，受体蛋白Pro-caspases和Nod样受体(Nod-like receptors,NLRs)通过接头蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)连接或直接识别并结合细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)被激活，进一步表达并催化IL-1β、IL-18合成、释放，最终执行焦亡任务[4]。细胞焦亡因依赖的炎性胱天蛋白酶不同而分为经典和非经典两种途径。病毒双链DNA和ROS刺激激活NLRP3炎症小体产生，NLRP3的选择性应答是高分子复合物Caspase-1形成的一种过程[5]，而Caspase-1是经典细胞焦亡途径必不可少的特异性依赖物。经典焦亡时胞质从破裂的胞膜外流及由核苷酸内切酶所介导染色体DNA降解均依赖caspase-1的激活，这也成为经典和非经典细胞焦亡鉴别的重要生物学特征。非经典的细胞焦亡则依赖caspase-4/5/11受体,其在胞内识别LPS随后直接剪切其下游底物GSDMD蛋白形成一种环状低聚物，该物质通过在质膜上打孔诱导细胞裂解死亡。近期研究[6]发现，由浆膜上控制小分子物质进出的Pannexin-1介导的离子通道开放可能是细胞焦亡的另一重要机制。研究[7]发现非经典的细胞焦亡通过Caspase-4/5/11诱导Pannexin-1断裂，激活嘌呤能离子门控受体P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打开胞膜通道，在细胞膜上形成小孔引起细胞内离子梯度平衡失调，最终诱发细胞焦亡。Derangère等[8]在结肠癌研究中证实细胞外腺苷三磷酸可激活嘌呤能离子门控受体P2X7(purinergic receptor P2X，ligand-gated ion)打开胞膜通道介导炎性复合物的形成诱导细胞焦亡。另外，离子通道开放所导致的K+外流激活NLRP3炎症小体是其诱导细胞焦亡的另一机制[9]。

2 细胞焦亡与炎症反应机制研究

2.1 细胞焦亡调控相关炎症因子

对细胞焦亡超微结构研究得知，细胞焦亡过程中胞膜上微孔和囊泡形成，细胞肿胀、破裂最终发生渗透性崩解，胞质成分外流启动机体炎性反应，使细胞焦亡成为特殊的细胞炎症性死亡方式。机体启动炎性反应是细胞焦亡的重要途径，炎症小体持续活化产生的相关白介素和促炎因子促进细胞焦亡发生。因此研究炎症反应、炎性小体有助于了解细胞焦亡炎症反应的调控方式。细胞焦亡免疫反应过程中的模式识别受体(pattern-recognition receptors，PRR)包括NLRs受体(NLRP1、NLRP3和NLRC4)、Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)和PYHIN蛋白(AIM2)，其均能直接或间接上调炎症小体中心分子和IL-1β、IL-18 前体的表达。研究[10]已发现可介导细胞焦亡的炎性小体有：NLRP3、NLRP1、NLRC4、AIM2和TLR4等。

2.1.1 NLRP3炎症小体 炎症小体的激活是细胞焦亡发生的关键，一些分布在胞浆中的NLRs家族可识别胞内信号活化caspase-1。而NLRP3炎症体是炎症反应的核心因子，作为固有免疫细胞内的危险信号感受器之一，目前研究最为广泛和全面。NLRP3是一种包括支架蛋白NLR、衔接蛋白ASC和效应蛋白炎性半胱天冬酶-1前体(pro cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Pro-caspase-1)等多个蛋白的复合物[11]，其可被多种内源性或外源性配体激活促进炎性因子IL-1β、IL-18的形成和分泌。复合蛋白NLRP3由LRR、NACHT及CARD或PYD 3部分组成[12]。这种结构在炎性小体组装和蛋白与蛋白间发挥作用尤其重要。接头蛋白ASC特异性拥有PYD结构域，有利于其与NLRP3中的PYD结构结合进行后续信号传递。ASC的特殊结构为caspase-1的激活提供了一个平台。研究[13]发现NLRP3的激活中ASC出现成核现象导致更多ASC募集。配体被LRR识别后组装炎症小体复合体，进而活化NLRP3，接收信号后的NLRP3首先发生结构重排，使PYD与ASC发生作用，ASC可通过CARD-CARD和PYD-PYD结构域相互作用完成NLRP3炎症小体的装配和pro-caspase-1的剪切和活化，从而募集Caspase-1介导IL-1β和IL-18的成熟和释放，诱发炎症反应及启动细胞焦亡[14-15]。

NLRP3炎症小体活化的上游机制与线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species，mROS)产生、钾离子(K+)外流、溶酶体破裂及溶解有关[16]。氧化应激始动靶点-ROS可通过半胱天冬氨酸蛋白酶、溶酶体蛋白酶或内切核酸酶的作用引起细胞焦亡、凋亡和自噬[17]。线粒体来源的ROS可激活NLRP3炎症小体介导细胞焦亡，因此ROS在细胞焦亡中的作用不可忽视。陈海燕[18]研究发现，镉暴露下的血管内皮细胞通过氧化应激通路促进线粒体ROS生成，激活NLRP3、增强caspase-1活性和IL-1β的产生介导细胞焦亡。另有研究[19]表明活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸和经小型干扰RNA沉默后的NLRP3或ASC可以有效抑制尼古丁诱导的caspase-1裂解、IL-18、IL-1β产生及原代人主动脉内皮细胞焦亡。另外低浓度钾离子环境可以活化NLRP3炎症小体[20]。氯喹还可上调ATP1B3 的表达，抑制钾离子外流，从而负调控NLRP3炎症小体复合物装配从而阻断NLRP3后续的炎症反应及其介导的细胞焦亡[21]。一方面NLRP3炎症小体作为宿主防御和识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)和损伤相关分子模式(danger associated molecular pattern，DAMPs)的重要物质，能保护机体免受病原微生物和内源性危险信号的攻击[22]；另一方面NLRP3通过介导促炎因子的水解、成熟和释放启动过度炎症反应及细胞焦亡可对机体造成不可逆损伤。

2.1.2 NLRP1、NLRC4炎症小体 同样是Caspase-1炎性小体亚基的NLRP1、NLRC4与NLRP3的不同在于其含有CARD结构域，过表达时可以不依赖ASC独自结合Caspase-1传导信号[23-24]。NLRP1基因的表达呈多样性但却是目前已知的唯一含有pyrin和CARD结构域NLR。NLRP1中的Pyrin结构域间接感知细菌毒素,使宿主细胞Rho家族小G蛋白失活进而以PYD与ASC蛋白结合的方式组装炎症小体复合物，介导细胞天然免疫[25]。NLRP1的类型具有多样性，其同系物众多，仅是鼠源性NLRP1基因表达就包括3类：NLRP1a、NLRP1b、NLRP1c。Boyden等[26]发现，NLRP1b基因识别LeTx后活化Caspase-1，可诱导细胞焦亡发生。但小鼠巨噬细胞通过NLRP1b识别LeTx并不具特异性。如B6遗传背景小鼠虽然能表达NLRP1a/b，但不能识别LeTx。研究[27]发现NLRP1在自身免疫性疾病类风湿性关节炎中可通过上调IL-1β介导细胞焦亡。

NLRC4又称IPAF，主要通过鞭毛蛋白(Flagellin)和三型分泌系统基体蛋白(PrgJ)参与机体抵抗革兰阴性菌感染过程[28-29]。研究[30]证实NLRC4能识别鞭毛蛋白，可以在低水平细菌载量时参与铜绿假单胞菌感染后caspase-1的活化。NLRC4结构域由N端CARD、C端LRR和中间NOD 3部分组成，正因其N端拥有与接头蛋白ASC的相同CARD结构域这一特征，使其不依赖接头蛋白ASC可直接募集和活化caspase-1。但与NLRP1不同，ASC在NLRC4募集caspase-1介导的细胞焦亡过程中仍具有重要作用。在对被沙门杆菌感染的巨噬细胞的研究中发现，NLRC4炎症小体可诱导巨噬细胞焦亡。ASC缺乏的细胞死亡中Caspase-1的激活量有所减少，白细胞介素IL-1β的分泌量也随之减少，这说明ASC在NLRC4激活的反应中非必须，但其拥有的CARD结构域会影响促炎反应和细胞死亡反应的剧烈程度[31]。

2.1.3 Toll样受体蛋白4-TLR4 Toll样受体4是一类包含N端和C端的I型跨膜蛋白受体。TLR4可识别并结合相应的PAMPs诱导炎症因子的表达，该过程与脂多糖(LPS)激活TLR4-N端的亮氨酸富集重复序列有关；TLR4-C端是一个包含Toll/IL-1的受体结构域，其信号传导途径与诸多白细胞介素具有同源性，因此LPS/TLR4信号转导成为激活下游信号通路介导炎症反应和细胞焦亡的研究热点。TLR4是由脂多糖、辅助受体髓系分化抗原、LRR结构蛋白CD14构成的三聚体受体，常通过启动信号级联反应释放肿瘤坏死因子、IL-6、IL-8等[32]。TLR4介导的细胞焦亡是一个通过装配NLRP3炎症小体的间接过程。NLRP3的激活途径按有无TLR4的参与分为经典和非经典两种途径。TLR4作为NLRP3经典的激活通路，其能通过MyD88促进小鼠巨噬细胞中NLRP3的脱泛素化调控细胞焦亡的发生[33]。经典过程为TLR4信号通路激活,促进NLRP3和Pro-IL-1β转录水平升高，介导IL-1β和IL-18前体产生预激活阶段和NLRP3/ASC/pro-caspase-1蛋白复合物组装, pro-caspase-1自剪切并活化成caspase-1随后发挥作用的修饰激活两个阶段[34]。非经典过程由Caspase-4/5/11识别LPS,将Gasdermin D蛋白切割成C端、N端两部分直接启动细胞焦亡,不依赖TLR4信号通路。

Toll样受体的表达具有多样性，其能够在多种细胞中表达。LPS对TLR4诱导的上皮细胞、内皮细胞、神经和神经胶质细胞等刺激炎症因子的释放，激活机体有效的免疫应答。LPS由结合蛋白LBP运送到单核及巨噬细胞胞膜表面上，再与其受体分子TLR4、CD14、MD-2共同作用，诱导TLR4信号转导，产生炎症反应和其他生物学效应[35]。组织来源的CD4+T细胞能够发生强烈的炎症反应，这些细胞能表达高水平的前体IL-1β以及NLRP3炎症体[36]。近期研究[37]发现，CD4+T细胞不仅能释放促炎因子扩大炎症反应还能激活NLRP3活化Caspase-1介导细胞焦亡。HIV感染过程中CD4+T淋巴细胞发生焦亡而引起炎症反应。研究[38]发现使用caspase-1抑制剂可阻断CD4+T淋巴细胞发生焦亡，保持其数目稳定以维持正常免疫功能。在对由ATP处理和耶尔森菌感染所引起的NLR激活的caspase-1研究发现，NLRs与TLRs均可增强其敏感性引起细胞内caspase-1的激活并产生大量的IL-1β和IL-18，引发炎症级联放大反应[39-41]。

2.1.4 AIM2炎症小体 黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)属ALRs家族成员，作为权威的炎性小体其结构包括C末端HIN和N端PYD结构域。研究发现,AIM2的激活机制与核周聚集体相关，接头蛋白ASC与N-PYD结合与此聚集体息息相关。其C-HIN结构域常可直接与病毒、细菌dsDNA结合,利用N-PYD结构与ASC结合活化Caspase-1，介导细胞焦亡。高度特异性的细胞焦亡，最初是在细胞急性损伤检测中发现，其与NLRs或AIM2启动细胞内、胞外PAMPs有关。NLRs和AIM2可以触发由ASC和pro-Caspase-1蛋白复合物的形成，并处理信号以诱导炎症级联反应[42]。AIM2炎性体在免疫反应中发挥重要的作用，研究[43]证明缺氧缺血性脑损伤鼠巨噬细胞中，AIM2的Pyrin结构域氨基酸可与ASC结合，对caspase-1 活化和IL-1β释放启动免疫应答引起细胞焦亡。AIM2有助于caspase-1的激活，但AIM2调控细胞焦亡的相关机制尚未完全明了。

2.2 焦亡执行终点蛋白-GSDMD

GSDMD蛋白是Gasdermin家族的一员，在免疫细胞和小肠黏膜上皮细胞表面广泛表达。GSDMD蛋白是所有炎性 Caspase 的共同底物蛋白，GSDMD只能由炎性Caspase激活特异性参与焦亡发生。实验证实活化的炎性Caspase能够在Asp276 位点上特异性裂解切割GSDMD蛋白，引起下游炎性反应因子IL-18，IL-1β的成熟和释放，激发炎性反应及细胞焦亡，从而奠定了GSDMD蛋白作为炎性Caspase底物在细胞焦亡中所发挥的重要作用。细胞焦亡时GSDMD被炎性Caspase切割形成GSDMD-N和GSDMD-C结构域，并发生低聚化。切割产物N端称效应域是发挥焦亡的主要功能结构域，它具有亲脂性和成孔活性。N端能选择性与质膜的内膜及细菌的膜结合，病原体因胞膜的破坏直接死亡;另一方面蛋白打孔后宿主细胞膜破裂病原体被释放到内环境中，被宿主的免疫系统识别杀伤。亲脂性表现在N端能特异性与细胞上的脂质结合锚定于生物膜上发挥破坏作用。研究[44]对DSDMD的打孔性进行了验证，细胞焦亡时GSDMD-N不会从细胞膜外破坏细胞的活性，而是与膜结合破坏细胞膜的完整性，导致胞膜内外环境渗透性紊乱，最终保护屏障丢失细胞溶胀破裂。C端具有亲水性，对细胞焦亡具有阻遏作用，静息状态下C 端与N端通过长环相结合是其抑制细胞焦亡的基础。Ding、Sborgi等[45-46]在实验中分别发现细胞发生焦亡后，GSDMD的N端在脂质体上形成蛋白孔洞，显微镜下其直径大约10～20nm。Chen等[47]还发现细胞形成类似“凋亡小体”的“焦亡小体”样突起。GSDMD介导细胞焦亡的机制还在于其能影响IL-1β/18 的释放。韩家淮团队研究证实无论经典或非经典途径的细胞焦亡都必须依赖焦亡执行蛋白GSDMD的介导。细胞中敲除GSDMD后，Pro-IL-1β仍可被Caspase-1切割成有活性的IL-1β，但细胞焦亡被抑制，回补GSDMD后细胞焦亡仍可发生。这可能与敲除GSDMD阻止了炎性因子分泌至细胞外有关[48]。结果表明GSDMD与IL-1β的成熟无关，但却是成熟IL-1β、IL-18释放分泌到胞外的必要条件。这也证实了GSDMD对于细胞裂解和炎性反应扩大的必要性。

3 细胞焦亡与糖尿病肾病

DN是一种代谢炎症性疾病。炎症反应在DN慢性肾脏损伤的发展中扮演关键角色。肾脏固有细胞：肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞和足细胞的损伤在炎症介导的DN发病及疾病进展中发挥至关重要作用。焦亡细胞的典型特征炎性小体表达增加、Caspase-1激活及下游促炎因子的大量释放等又能反向导致DN细胞死亡增加，可以从炎症反应作为突破口探讨DN与细胞焦亡的发生机制。

DN病程中肾脏固有细胞的减少或缺失会导致肾损伤及影响肾小球滤过屏障过滤的正常发挥出现蛋白尿。而细胞焦亡信号通路中的关键蛋白ASC、NLRP3、Caspase-1等均与DN肾脏固有细胞死亡息息相关。急性缺血性肾损伤时NLRP3/caspase-1轴激活，炎症因子和分子释放导致肾小管上皮细胞形成大量孔洞，细胞焦亡率显著增加,而使用siNLRP3腺病毒抑制NLRP3及其他白介素表达后焦亡细胞显著减少[49]。线粒体功能障碍是肾脏的缺血再灌注损伤(H/R)疾病中肾小管上皮细胞损伤的早期事件，H/R损伤时线粒体平衡蛋白DRP1表达上调，活性氧增加，ROS通过NLRP3诱发炎症介导焦亡。使用线粒体分裂抑制剂(Mdivi-1)能有效减少活性氧产生，抑制肾小管上皮细胞焦亡发生，保护肾脏功能。线粒体功能障碍是肾小球足细胞损伤的早期事件,可通过阻断线粒体ROS/NLRP3通路，阻止DN细胞炎症反应及焦亡发生。研究证实，DN的高血糖症及氧化应激等可导致细胞内线粒体分解代谢增加，活性氧积聚增多，触发NLRP3炎性小体途径，最终导致细胞发生焦亡。DN病程中高糖、高胰岛素等造成的细胞氧化应激、炎症反应、线粒体损伤等又是细胞焦亡的危险因素。研究[50]证实miR-497可靶向定位NLRP1直接或间接调节TLR4和NF-kB炎性小体, caspase-1 水平，减少白细胞介素IL-1β的表达抑制细胞炎症反应保护细胞。李嵘等[51]研究发现miR-497抑制糖尿病并发症细胞焦亡是通过靶定NLRP1实现，miR-497靶定NLRP1并降低NLRP1-3'UTR报告基因的萤光素酶活性抑制其表达，最终抑制肾小球系膜细胞焦亡。于艳等[52]研究发现，高糖高胰岛素培养的HRMC细胞焦亡增多伴随NLRP1炎症小体激活增加。利用Western Blot、RT-PCR检测各组48 h时间段细胞焦亡相关炎症因子NLRP1、IL-1β、TNF-α、caspase-1 水平等发现，炎症因子在蛋白表达及mRNA水平表达上与对照组相比均上调。而后对HRMC转染NLRP1 小干涉RNA(siNLRP1)后，与非转染组相比发现NLRP1 蛋白水平明显降低，而后NLRP1炎症反应轴上的各个炎症因子的mRNA 和蛋白水平均较非转染组明显降低。

4 小结与展望

炎症小体被激活，而后介导下游介质Caspase-1活化，最终命令终端核心蛋白GSDMD执行打孔效应是细胞焦亡发生过程中必不可少的几个环节。关键物质炎症小体在细胞焦亡中不可或缺。炎性小体激活的途径包括：细胞自噬异常、线粒体ROS异常产生及某些金属离子离子态平衡失调等。如前所述吞噬溶酶体紊乱也参与了NLRP3炎症小体的激活，但其上游机制是否与细胞焦亡的激活相关联，是否也参与细胞焦亡进程还有待研究。细胞焦亡作为细胞生命终结的特殊形式，犹如一把“双刃剑”适度的细胞焦亡有利于保护机体抵抗内外源性危险因素损伤；另一方面，炎症反应剧烈细胞焦亡过度也是临床疾病发生和机体严重病理损伤的主要因素。炎性小体、胱天蛋白酶在DN细胞焦亡研究中已有所涉及，但研究尚浅；而Caspase底物蛋白GSDMD在DN研究中仍未涉及，其是否发挥作用，怎样发挥作用依然未知。我们应在完善目前已有研究成果的基础上，深化打孔效应机制研究的动物和细胞实验，进一步揭示细胞焦亡调控所涉及的新机制及其与DN的关系，为DN防护和治疗提供新靶点。