雷公藤内酯醇联合热疗对肝癌细胞增殖、凋亡及p62蛋白表达的影响

丰小敏，马瑞，夏佩，何昊，魏柏

(华中科技大学同济医学院附属梨园医院，武汉430077)

雷公藤内酯醇(TPL)是中草药雷公藤最重要的活性成分之一，具有广泛的抗炎、免疫抑制及抗肿瘤作用[1]。TPL既能抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，又能防止肿瘤转移[2,3]。另外，TPL与其他药物联用时能增强促肿瘤细胞凋亡作用[4]。但TPL安全窗口窄，临床用药隐患较大；然而，肿瘤热疗为一种无创或微创的治疗手段。所以，本研究拟观察TPL联合热疗处理肝癌细胞，以期能减少TPL用量，在不增加治疗不良反应发生风险的同时极大提高TPL疗效。泛素蛋白酶体系统(UPS)和自噬溶酶体系统[5]是人体内主要存在的两种蛋白降解系统，通过降解受损、突变或错误折叠的蛋白质，来维持细胞内环境稳定，保障细胞正常的生理代谢[6]。p62是SQSTM1编码的一种多功能的泛素化结合的折叠蛋白，能同时参与体内UPS和自噬溶酶体降解过程[7]，在NF-κB[8]、蛋白酶体通路[9]、细胞凋亡[10]及自噬调控[11]等信号通路中起重要作用。2017年6月～2018年3月，我们观察了TPL联合热疗对肝癌细胞凋亡及p62蛋白表达的影响，为进一步提高TPL抗癌活性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 肝癌HepG2细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司)，细胞培养皿、细胞培养瓶(Corning公司)，血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)；MTT(Sigma公司)，DMEM(Gibco公司)，胎牛血清(Invitrogen公司)，Trise-Base(Amresco公司)；小鼠单抗β-actin(武汉博士德生物工程有限公司)，小鼠单抗p62(Abcam公司)，HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)，电化学发光试剂(ECL底物液，Thermo公司)；HCl(信阳市化学试剂厂)，二硫苏糖醇(DTT，Biosharp公司)，溴酚蓝(Amresco公司)，NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，苯甲基磺酰氟(PMSF,上海碧云天生物科技有限公司)；倒置显微镜(Olympus公司)，CO2恒温培养箱(Sanyo公司)，酶标仪(Thermo公司)，流式细胞仪(Beckmancoulter公司)，细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物科技有限公司)，垂直电泳槽、电转仪(北京六一仪器厂)，聚偏氟乙烯膜(PVDF，Millipore公司)，显影定影试剂盒(天津市汉中摄影材料厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞复苏与传代培养 将HepG2细胞从液氮中取出、解冻，移入含5 mL培养基的离心管中；离心收集细胞，用含10%胎牛血清的培养基，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养悬浮细胞。细胞融合度达到80%时，对细胞进行传代，制成单细胞悬液；按1∶3传代，扩大培养；取对数生长期生长状态良好的细胞，用完全培养基调整细胞密度为3×104/mL；接入96孔板，每孔100 μL细胞悬液；同时设空白孔，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μL无菌PBS)。

1.2.2 细胞分组与干预方法 将细胞随机分为4组，对照组不处理，TPL组加入终浓度20 nmol/L的TPL作用24 h，热疗组于43 ℃加热150 min，联合组采用TPL联合热疗处理(先加入TPL使其终浓度为20 mmol/L,然后43 ℃ 150 min，培养24 h)。各组均于37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。

1.2.3 HepG2细胞增殖情况观察 采用MTT法。每孔加入10 μL MTT，37 ℃培养4 h；吸出培养基，加入150 μL DMSO震荡10 min；酶标仪测定各孔568 nm的光密度(OD)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=1-(实验孔OD值-空白对照孔OD值)/(对照孔OD值-空白对照孔OD值)

1.2.4 HepG2细胞凋亡情况观察 采用流式细胞仪。用不含EDTA的0.25%胰酶消化细胞，收集细胞；以1 500 r/min离心5 min去上清，加PBS重悬；用PBS洗2次后,以1 500 r/min离心5 min。按照AnnexinV-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒操作说明进行染色：加入500 μL Binding Buffer，重悬细胞；以5 μL Annexin V-APC混匀后，加入5 μL 7-AAD室温避光反应5～15 min；上流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.5 HepG2细胞中p62蛋白检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，冰上以细胞裂解液裂解30 min，移至1.5 mL离心管中； 以12 000 r/min离心5 min，将上清分装保存。取40 μg蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳并转移至PVDF膜；以封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST)封闭2 h，加入一抗β-actin(1∶200)和p62(1∶2 000)，4 ℃孵育过夜；TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗(1∶50 000稀释)，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃摇床孵育2 h；TBST充分洗涤PVDF膜5～6次，加入ECL反应数分钟；待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜；X线胶片压片后，依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片，晾干胶片；扫描胶片，用Band Scan分析胶片灰度值，以目的蛋白与内参β-actin条带灰度比值表示p62蛋白相对表达量

2 结果

2.1 各组HepG2细胞增殖抑制率比较 TPL组、热疗组及TPL联合组细胞增殖抑制率分别为11.33%±1.53%、16.33%±3.06%、26.33%±3.16%，联合组细胞增殖抑制率高于TPL组、热疗组(P均<0.05)，TPL组、热疗组细胞增殖抑制率差异无统计学意义。

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组、TPL组、热疗组及联合组细胞凋亡率分别为3.82%±0.10%、10.91%±0.71%、15.04%±0.08%、20.76%±0.28%，对照组

2.3 各组细胞中p62蛋白表达比较 对照组、TPL组、热疗组及联合组p62蛋白相对表达量分别为0.12±0.01、0.38±0.02、0.44±0.02、0.81±0.04， 对照组

图1 各组HepG2细胞中p62蛋白表达情况

3 讨论

原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，据统计我国肝癌分别占全国恶性肿瘤发病率和病死率的第4位和第2位[12]，严重威胁着人们的身体健康和生命财产安全。手术仍是肝癌治疗的主要手段，同时需联合放化疗、生物治疗及中医中药等手段进行综合治疗。肝癌生存期短，尤其是中晚期不能手术患者的生存期更短。研究报道，中医药能明显延长中晚期肝癌患者的生存期，使Ⅱb、Ⅲa、Ⅲb期患者明显获益[13]。因此，对中医中药联合治疗方案的探寻具有重要的现实意义。

雷公藤是卫矛科雷公藤属多年生植物，多生长于山林地区，我国主要分布于江苏、安徽、江西、浙江及台湾等地[14]。TPL是雷公藤的主要活性成分之一，具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等多种生物活性[15]。TPL与其他药物联用时具有协同作用，能进一步抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡。Ho等[4]研究发现，TPL明显增强了顺铂和氟尿嘧啶的细胞毒性作用；同时，Alsaied等[16]发现，TPL与索拉菲尼联用时，显著增强索拉非尼抗肿瘤作用，增强Caspase-3活性，促进肿瘤细胞凋亡。热疗作用于肿瘤细胞时能增加细胞通透性，通过提高细胞内化疗药物浓度，增强化疗药物的杀伤作用；同时，能增强化疗药物的细胞毒性，干扰DNA和蛋白质合成扰乱细胞膜的功能，进一步增加其通透性导致细胞凋亡[17]。热疗与单克隆抗体联用时也具有协调作用，能够促进肿瘤细胞凋亡[18]。本研究结果显示，HepG2细胞分别经TPL和热疗处理后，细胞增殖率下降，而TPL和热疗联合处理后，细胞增殖率明显下降，这与其他相关研究是一致的。流式细胞仪检测凋亡结果时也发现，TPL联合热疗处理后细胞凋亡率明显增加。因此，热疗作为一种相对无创的抗肿瘤手段，能一定程度上提高TPL促进细胞凋亡的作用。

细胞处于肿瘤微环境即营养缺乏的状态下，肿瘤细胞需要足够的营养及能量来维持其生存所需要的代谢物质。这样的情况下，细胞自噬能为生存代谢反应提供所需要的底物来源[19]。抑制肿瘤细胞自噬能显著抑制细胞代谢，进而抑制肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤增大或转移[20]。通常自噬激活，自噬通路降解p62蛋白，使其含量降低，因此p62蛋白表达水平与自噬互为负相关。另一方面，p62蛋白也参与了外源性凋亡通路的调节。Pan等[21]研究发现，p62蛋白能够减少Caspase-8降解，维持Cleaved Caspase-8二聚体的形成，促进肿瘤细胞凋亡。本研究结果显示，TPL联合热疗处理后细胞中p62蛋白相对表达量高于单一处理的细胞。这说明联合处理后肿瘤细胞自噬明显被抑制，细胞代谢受到抑制，肿瘤细胞难以耐受营养缺乏微环境，促进细胞死亡；同时，表达增高的p62蛋白能进一步诱导并调控外源性凋亡途径，诱导肝癌HepG2细胞凋亡，增强TPL的抗肿瘤作用。

综上所述，TPL联合热疗能够明显的抑制肝癌HepG2细胞增殖，促进其凋亡。其可能机制为TPL联合热疗能抑制肿瘤细胞自噬，进而抑制肿瘤微环境下肝癌HepG2细胞代谢，促进细胞死亡；同时自噬抑制，p62蛋白降解减少，高表达量的p62蛋白可减少Caspase-8降解，进一步促进凋亡，以获得更大的抗肿瘤疗效。