lncRNA uc.48+对2型糖尿病大鼠肝糖原的影响

余克花，李 琳，王梦珂，刘双梅，梁尚栋

(南昌大学1. 医学实验教学中心、2. 基础医学院生理学教研室，江西 南昌 330006)

糖尿病(diabetes mellitus，DM) 是一组代谢性临床综合征，随着社会的发展和人们生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年升高。在发达国家，糖尿病患病率已达3%～7%，成为仅次于癌症、艾滋病、心脑血管病之后第4 位需要优先考虑的疾病，已成为世界第5 位死亡主因[1-4]。我国糖尿病人群的构成，以2型糖尿病为主，占糖尿病人群的90%以上，严重影响着人民健康和社会发展[1,3,5-6]。2型糖尿病最主要的症状是高血糖，高血糖是引发糖尿病并发症的主要原因，据估计，全球6个人里面就有1个人处于患糖尿病并发症的危险中[1-6]。

葡萄糖激酶(glucokinase，GK)是己糖激酶家族中的一员，分子质量为52 ku，由448个氨基酸残基构成[5,7]。肝脏GK参与葡萄糖磷酸化，加速糖原合成及葡萄糖代谢。GK是糖代谢途径中的关键酶，特异性地存在于胰腺β细胞和肝细胞，可促进胰岛素分泌和葡萄糖代谢，参与糖代谢的各条途径[5,7-8]。肝脏中的GK是糖酵解过程中第一步的限速酶，催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，后者在胰岛素作用下，经过糖原合成途径合成肝糖原储存起来。因此，肝脏中的GK的主要作用是促进糖酵解，加速糖原合成和抑制糖异生，调节肝细胞对葡萄糖的摄取与利用，从而有效控制体内血糖平衡[5,8]。

非编码RNA(noncoding RNA, ncRNA)是一类不编码蛋白质，但具有生物学调控功能的RNA分子，同时与一些重要疾病的病理生理过程相关[3,9-10]。长度大于200个碱基(200 nt)为长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA)。本项目前期用SOLiD高通量测序，并通过生物信息学预测和分子生物学验证，确定大鼠肝脏存在lncRNA uc.48+ (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc?hgsid=427967671_gIIKDUiyguaFXCbRBiWSM7gFO gqn&c=chr2&o=20462844&t=20463142&g=ct_Ultra_7128&i=%28null%29+uc.48)[9], 并发现糖尿病模型大鼠肝脏lncRNAuc.48+表达较对照组明显增加，提示肝脏的lncRNAuc.48+与糖尿病的病理变化有关。本实验应用2型糖尿病模型大鼠，观察lncRNAuc.48+小干扰RNA对2型糖尿病模型大鼠血糖的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组Sprague-Dawley(SD)♂大鼠，40只，清洁级，体质量200 g左右，购于南昌大学医学部实验动物中心，动物使用许可证号：SYXK(赣)2015-0001。大鼠分笼饲养，每笼饲养7只，温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，昼夜明暗交替12 h/12 h,自由饮水。适应1周后，禁食不禁水12 h，剪尾采血测血糖。将大鼠随机分成对照组(Control)和模型组，对照组始终喂养普通饲料(由南昌大学医学院实验动物科学部提供)，模型组喂养高糖高脂饲料(基础饲料66.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸钠1%，加水做成条状，放在恒温鼓风干燥箱中80 ℃干烤3 h)。第5周末(即模型组喂高糖高脂饲料4周后)，所有大鼠禁食不禁水12 h测血糖。模型组大鼠空腹腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)30 mg·kg-1(临用前将STZ溶解于4 ℃冰箱预冷的pH为4.2的0.1 mol·L-1柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液中，配制成2.5 g·L-1的STZ溶液)。第6周末，空腹血糖小于7.8 mmol·L-1的大鼠再注射STZ 30 mg·kg-1一次，第7周末，测空腹血糖大于7.8 mmol·L-1为成模标准。

lncRNAuc.48+小干扰RNA(siRNA)序列由Invitrogen公司提供，靶序列为5′-GGCACTACTACTTGCAGAA-3′；阴性对照scrambled siRNA (NC siRNA)购自Invitrogen公司。在体转染试剂由EntransterTM公司提供。根据EntransterTM在体转染说明书，实验第10周末，对糖尿病造模成功的大鼠进行lncRNAuc.48+siRNA在体小干扰实验。成模后的大鼠再随机分成：糖尿病模型+生理盐水对照组、糖尿病模型+lncRNAuc.48+siRNA处理组、糖尿病模型+NC siRNA处理组。糖尿病模型小干扰RNA处理组的大鼠分别通过尾静脉注射lncRNAuc.48+小干扰RNA或scrambled siRNA。对照组和糖尿病模型组均尾静脉注射相同体积生理盐水。1周后，取各组大鼠标本检测相关指标。

1.2试剂GK抗体(Abcam公司)；p-Akt1与Akt1抗体，购自以色列Alomone Labs，Jerusalem公司；肝/肌糖原试剂盒(南京建成生物工程研究所)；β-actin一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗(中杉金桥)；GK及β-actin引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物)。

1.3仪器罗康全活力型血糖仪(德国罗氏公司)；ABI7500实时定量PCR仪(美国ABI公司)；凝胶成像仪(Bio-Rad公司)。

1.4血糖的测定分别于第1、5、10、11周末，用血糖仪测量各组大鼠空腹血糖(禁食12 h，自由饮水)和餐后血糖，每次测量由相同人员操作，其他条件保持一致。剪尾采血方法：首先用酒精棉球擦拭大鼠尾端，然后用消毒剪刀剪去尾尖2 mm左右，将血直接滴在已准备好的血糖试纸上测量。采血结束后，对大鼠尾端伤口行碘伏消毒。

1.5肝糖原含量测定取各组大鼠肝脏，用DEPC处理过的PBS清洗，具体操作按试剂盒说明书进行，用全自动生化仪测定。最后根据公式计算肝脏组织糖原含量: 糖原含量(mg/g 组织)=(测定管OD值-标准管OD值)×标准管含量×样本测试前稀释倍数×样本测试过程中稀释倍数÷1.11。

1.6实时定量PCR(qPCR)检测肝脏GKmRNA表达使用TRIzol总RNA提取试剂盒(北京天根生物公司)从肝脏中提取总RNA。使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(美国Fermentas公司)，按照说明书合成cDNA。使用Primer Express 3.0软件(Applied Biosystems)设计引物， 引物序列如下：GK上游引物: 5′-GGCTTCACCTTCTCCTTCCC-3′，下游引物: 5′-CACATTGGCGGTCTTCATAG-3′，产物223 bp；β-actin 上游引物: 5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′，下游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，产物240 bp；uc.48+ 上游引物:5′-GCAAACTGGATGAGGAT-3′ ，下游引物:5′-GTAGTGCCACAAGGAGA-3′。使用SYBR®Green Master Mix ABIPRISM®7500序列检测系统(Applied Biosystems)进行定量PCR。热循环参数为95 ℃，持续30 s，然后在95 ℃下进行40个循环的放大5 s，60 ℃放置30 s。通过熔解曲线确定扩增特异性，并使用ABI7500 PCR仪器内的软件分析处理结果。

1.7蛋白印迹检测肝脏GK、p-Akt1与Akt1的含量将肝脏置于匀浆器中，加入蛋白提取液(RIPA)和PMSF，于冰上进行匀浆，提取总蛋白，按照BCA试剂盒说明书检测蛋白浓度。获取的蛋白按照20 μg对应的体积加样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。常温下5%的脱脂牛奶(脱脂奶粉+TBST液)封闭2 h，分别加入一抗4 ℃孵育过夜。次日洗膜后,膜放于二抗中孵育2 h后，用TBST洗膜3次，每次10 min。凝胶成像系统显影液曝光。以β-actin为内参，凝胶成像系统进行条带灰度值扫描，用Image-Pro Plus图像分析系统观察分析综合光密度。以各组β-actin条带的综合光密度值标化其相应组目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1糖尿病模型大鼠肝脏uc.48+的表达Fig 1的实时定量PCR检测显示，糖尿病模型(DM)大鼠

肝脏uc.48+的表达水平较对照组明显增加(P<0.05)。

Tab 1 Changes of blood glucose before uc.48+siRNA

**P<0.01vscontrol group

Fig 1 Expression of lncRNA uc.48+ in

*P<0.05vscontrol group

2.2uc.48+siRNA对大鼠血糖的影响Tab 1结果显示，实验开始时(1周末)，正常组大鼠与糖尿病模型组大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)和餐后血糖(postprandial blood glucose，PBG)差异无统计学意义(P>0.05)；到第10周末，注射STZ后，糖尿病模型组大鼠与正常对照组大鼠相比，餐后血糖和空腹血糖均升高(P<0.01)。Tab 2结果显示，第11周末，与DM组相比，DM+uc.48+siRNA处理组空腹血糖和餐后血糖均有所降低(P<0.05)。DM组与DM+NC siRNA组相比，差异无统计学意义。

Tab 2 Changes of blood glucose after

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group

2.3uc.48+siRNA对大鼠肝糖原的影响各组大鼠肝糖原检测结果显示(Tab 3)，DM组与对照组相比，肝糖原明显下降(P<0.01)，DM+uc.48+siRNA组与DM组相比，肝糖原明显升高(P<0.05)。DM组与DM+NC siRNA组相比差异无统计学意义。

Tab 3 Effect of uc.48+siRNA on liver

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM group

2.4uc.48+siRNA对大鼠肝脏GKmRNA表达的影响如Fig 2所示，与正常对照组相比，糖尿病模型组肝脏中GK mRNA的表达明显降低(P<0.01)；uc.48+小干扰RNA处理组与糖尿病模型组相比，肝脏中GK mRNA的表达明显升高(P<0.01)。DM组与DM+NC siRNA组相比差异无统计学意义。

Fig 2 Expression of GK mRNA in liver

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group

2.5uc.48+siRNA对大鼠肝脏GK蛋白表达的影响如Fig 3所示，与正常对照组相比，糖尿病模型组肝脏中GK的表达明显降低(P<0.05)；uc.48+小干扰RNA处理组与糖尿病模型组相比，肝脏中GK的表达明显升高(P<0.01)。DM组与DM+ NC siRNA组相比差异无统计学意义。

2.6uc.48+siRNA对大鼠肝脏Akt1、p-Akt1蛋白表达的影响Fig 4结果显示，各组间Akt1蛋白含量差异无显著性。与正常对照组相比，糖尿病模型组肝脏中p-Akt1的表达明显降低(P<0.01)；uc.48+小干扰RNA处理组与糖尿病模型组相比，肝脏中p-Akt1的表达明显升高(P<0.01)。DM组与DM+NC siRNA组相比差异无统计学意义。

Fig 3 Expression of GK protein in

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsDM group

Fig 4 Expression of Akt1 and p-Akt1 protein in

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsDM group

3 讨论

糖尿病是以高血糖、高血脂为特征的代谢紊乱综合征[2,4]。本实验应用高糖高脂饲料喂养联合小剂量STZ注射，诱导建立类似2型糖尿病大鼠模型，模型组大鼠检测餐后血糖、空腹血糖均较对照组明显增高，达到了糖尿病的诊断标准，说明2型糖尿病建模成功。人类基因组lncRNAs有481种超保守元件，其特征为长度大于200 bp，且在不同物种之间具有超级保守性[11]。uc.48+是lncRNA[9]。本研究观察到2型糖尿病模型大鼠肝脏的lncRNA uc.48+表达增加，提示uc.48+与2型糖尿病有关。实验观察到糖尿病模型大鼠用uc.48+小干扰RNA处理后，餐后血糖、空腹血糖较模型大鼠降低，表明uc.48+小干扰RNA可降低糖尿病模型大鼠升高的血糖。

本实验中，糖尿病模型大鼠肝糖原检测显示，糖尿病模型组大鼠肝糖原较对照组明显降低，糖尿病模型大鼠加uc.48+小干扰RNA处理后，肝糖原的合成较糖尿病模型组大鼠增多，提示uc.48+小干扰RNA可通过促进葡萄糖代谢途径，降低血糖。研究表明，普通糖尿病患者及糖尿病动物模型体内GK活性明显降低，它可能对糖尿病的发生、发展产生重要影响[8]，而增加GK活性可促进葡萄糖的磷酸化，促进糖原合成和胰岛素释放，从而改善糖耐量异常，提高胰岛细胞功能，改善糖尿病症状[5,7-8]。实验中还观察到糖尿病模型组肝脏GK mRNA和蛋白表达较对照组明显减少，经uc.48+小干扰RNA干预后，肝脏GK mRNA与蛋白表达较糖尿病模型组明显增加。血糖增高时，GK可使肝糖原合成增加，抑制肝脏糖异生，以维持血糖稳态[5,7-8]。

Akt是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可引起Ser/Thr磷酸化，参与肝脏组织的分化、生长，可调节胰岛素介导的糖代谢[12]。激活的Akt可促进肝细胞GK mRNA的表达[13]。本研究糖尿病模型大鼠实验结果表明，激活Akt可增强肝脏GK的表达。研究结果提示，uc.48+小干扰RNA处理后，可增加Akt磷酸化激活，促进GK的表达增加、肝糖原合成，进而降低糖尿病模型大鼠升高的餐后血糖和空腹血糖。

总之，本研究发现uc.48+小干扰RNA可降低2型糖尿病模型大鼠升高的血糖、增加肝糖原合成，其机制涉及增加GK的表达。