亚硒酸钠通过Keap1/Nrf2/ARE信号通路诱导人肺腺癌A549细胞凋亡

田崇梅，夏道宗，邢梦雨，郭 璐，张晓熙，赵鑫钰

(浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053)

肺癌发生于支气管黏膜上皮，研究显示，肺癌的死亡率位居我国恶性肿瘤死亡率的第1位[1]。硒(selenium，Se)是一种关键的营养微量元素，在人体的发病机制与稳态中扮演着重要角色[2]。本研究组在前期已经证实了亚硒酸钠(sodium selenite)体外具有螯合铅的作用[3]，并有研究显示亚硒酸钠可以诱导肿瘤细胞凋亡[4]，包括人肺腺癌A549细胞[5]、肝癌细胞[6]等，但其诱导肿瘤细胞凋亡的机制尚不明确。Kelch样ECH相关蛋白1 (Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)/核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)信号通路是重要的抗氧化应激通路，也是近十年来抗氧化研究领域的一大热点，对这一通路的深入研究，将能够解释或部分解释机体对癌症进行自身防御抵抗的机制，此通路是肺癌治疗的一个潜在靶点[7]。本研究以人肺腺癌A549细胞为研究对象，通过观察细胞增殖、细胞凋亡、细胞形态学、抗氧化指标检测等，研究亚硒酸钠对人肺腺癌A549细胞的作用。初步探讨亚硒酸钠对人肺腺癌A549细胞凋亡的影响，为探索其抗肺癌作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1药物与试剂亚硒酸钠(sodium selenite)、二甲亚砜 (DMSO)、MTT，均购自美国Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培养基、磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution, PBS)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗，购自美国Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，购自美国BBI Life Sciences公司；Hoechst 33342试剂盒，购自碧云天生物技术公司；Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒，购自美国BD公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、还原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒，均购自南京建成试剂公司；核蛋白提取试剂盒，购自美国Thermo Scientific公司；裂解液、BCA蛋白试剂盒，购自康为世纪生物公司；Keap1、Nrf2、血红素加氧酶1(hemeoxygenase 1，HO-1)、β-actin、Lamin B抗体，均购自美国Cell Signaling公司。

1.2人肺腺癌A549细胞的培养人肺腺癌A549细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。在37 ℃恒温水浴箱中快速解冻A549细胞，将细胞接种于含有10% FBS的RPMI 1640完全培养基中(含100 U·L-1青霉素和100 U·L-1链霉素)，在37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养细胞，2～3 d传代1次，传代时用胰蛋白酶消化2 min，1 ∶3传代，取对数期生长的细胞进行实验。

1.3细胞活力检测取对数生长期的A549细胞(1×107·L-1)接种于96孔板中，每孔 200 μL，培养24 h，细胞长至70%～80%，吸弃孔内培养基，加入100 μL含不同浓度药物的培养液，用RPMI 1640无血清培养液稀释亚硒酸钠，使其终浓度分别为2.5、5、10、15、20 μmol·L-1，空白对照组为RPMI 1640无血清培养液，每组设6个复孔。培养24 h后，各孔加入终浓度为5 g·L-1MTT液20 μL，继续培养4 h，将原有孔中液体吸出，每孔加入150 μL DMSO，放在摇床上低速震荡10 min，待紫色结晶物充分溶解后，置于多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司)上，检测波长为490 nm的吸光度值(optical density，OD)。抑制率=(1-实验组OD/空白对照组OD)×100%。

1.4细胞形态学观察取对数生长期的A549细胞(1×109·L-1)接种在6孔板中，分为正常组和亚硒酸钠组(2.5、5、10 μmol·L-1)，待细胞培养24 h后，进行如下操作：① 使用倒置荧光显微镜(日本Olympus公司)观察无荧光染色的各组细胞状态；② 每孔加入1 mL Hoechst 33342，室温避光染色15 min，吸弃染色液，PBS液洗3次，每次5 min，置于倒置荧光显微镜，观察细胞形态学变化。

1.5细胞凋亡检测取对数生长期的A549细胞，用亚硒酸钠(0、2.5、5、10 μmol·L-1)培养24 h后，用PBS洗涤细胞2次，胰蛋白酶消化后，收集细胞，离心吸弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC 结合液，轻轻重悬细胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，再加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，混合均匀。室温避光孵育10～20 min，孵育过程中重悬细胞2～3次以改善染色效果，随后置于冰浴中，立即用流式细胞仪(美国BD公司)检测，AnnexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。

1.6氧化应激参数检测ROS是细胞在代谢过程中产生的一系列活性氧簇， 是氧化应激反应的一个重要指标。MDA是脂质过氧化终产物之一，常作为评判脂质过氧化的指标。ROS导致的氧化应激反应是细胞凋亡中的一个重要环节，ROS的变化可以引发氧化还原反应，从而影响MDA水平的变化，最终诱发细胞凋亡[7]。用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS水平，用无血清的RPMI 1640培养基稀释DCFH-DA，使工作液终浓度为20 μmol·L-1，37 ℃孵箱中避光温育30 min，每个组别设6个复孔，置于激发波长为485 nm，发射波长为525 nm的多功能酶标仪上检测，并且通过激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)进行荧光成像分析。

将对数生长期的A549细胞用亚硒酸钠(0、2.5、5、10 μmol·L-1)处理24 h后，BCA法测定样本蛋白浓度后，按照试剂盒说明书进行操作，WST-1法检测SOD活力，微量酶标法检测GSH含量，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

1.7Westernblot检测A549细胞经药物处理24 h后，终止细胞培养，吸除培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入裂解液60 μL，置冰浴中裂解30 min，12 000 r·min-1离心7 min，获得总蛋白样品。根据核蛋白抽提试剂盒，获取细胞质与细胞核蛋白。BCA比色法测蛋白浓度，蛋白定量后，在蛋白样品中加入适量SDS-PAGE上样缓冲液，100 ℃水浴变性10 min。取40 μg总蛋白上样，经8%或10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转至PVDF膜，用TBS-T稀释的5%脱脂牛奶封闭2 h，加入抗体Keap1、Nrf2、HO-1、Lamin B和 β-actin，4 ℃孵育过夜(β-actin作为总蛋白和细胞质中内参蛋白，Lamin B作为细胞核中内参蛋白)，TBS-T洗膜3次，每次10 min，加入对应的荧光兔源或鼠源二抗，室温孵育2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min，荧光影像分析仪(美国LI-COR公司)显影和扫描。ImageJ 1.41软件(美国Bethesda公司)进行数据分析。

2 结果

2.1亚硒酸钠对A549细胞增殖的抑制作用Fig 1的MTT结果显示，亚硒酸钠具有抑制人肺腺癌A549细胞增殖的作用，随着药物浓度的增加，其抑制率也随之增加(P<0.05)，提示亚硒酸钠可抑制人肺腺癌A549细胞的增殖。

Fig 1 Inhibitory effects of sodium selenite on proliferation of A549

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

2.2亚硒酸钠对A549细胞形态的影响未经染色的人肺腺癌A549细胞见Fig 2A，随着亚硒酸钠浓度升高，变圆的细胞数量逐渐增加，细胞贴壁能力变弱，漂浮细胞数量增多，说明凋亡细胞不断增加。Hoechst 33342荧光染色结果如Fig 2B所示，正常组细胞核完整，荧光着色分布均匀，荧光呈弥散状态，未出现细胞凋亡现象；随着亚硒酸钠浓度的升高，细胞出现皱缩，细胞染色质呈颗粒荧光状，细胞核呈折光性强的亮蓝色小点，致密浓染，形态不规则且聚集成团，出现细胞凋亡的典型特点，说明亚硒酸钠可诱导A549细胞凋亡。

2.3亚硒酸钠对A549细胞凋亡的影响Fig 3的流式细胞术检测结果表明，亚硒酸钠可诱导人肺腺癌A549细胞凋亡，随着亚硒酸钠浓度的升高，凋亡细胞比例逐步增加，当亚硒酸钠浓度为10 μmol·L-1时，人肺腺癌A549细胞凋亡率达到42.06%，与“2.2”结果相一致，进一步说明亚硒酸钠具有诱导A549细胞凋亡的作用。

Fig 2 Effects of sodium selenite on morphology of A549 cells(×100)

A:Fluorescence photomicrograph of unstained A549 cells;B:Fluorescence photomicrograph of A549 cells stained with Hoechst 33342.

Fig 3 Effect of sodium selenite on apoptosis of A549

A:Effects of sodium selenite on apoptosis were determined using flow cytometry;B:Statistical analysis of the apoptotic rate.**P<0.01vscontrol group.

Fig 4 Effects of sodium selenite on oxidative stress of A549

A:ROS production was analyzed by laser confocal microscope(×200); B: ROS production was analyzed by multi-detection reader; C～E: Effects of sodium selenite on SOD,GSH and MDA activities.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

2.4亚硒酸钠对氧化应激指标的影响如Fig 4A、4B所示，ROS的水平与亚硒酸钠的浓度呈依赖性关系。随着亚硒酸钠浓度的不断增加，ROS的产生量逐渐升高，绿色荧光逐渐增加。与对照组相比，亚硒酸钠组ROS的产生量明显升高，其中高、中浓度组ROS的增加量较低浓度组更为明显，说明亚硒酸钠诱导A549细胞凋亡与氧化应激反应有关，可能是通过促进ROS产生来实现的。MDA为脂质过氧化的代谢产物，其含量可以间接证明细胞氧化损伤的程度。SOD和GSH是体内非常重要的抗氧化剂和自由基清除剂，其含量可以间接反映细胞抗氧化损伤的能力。如Fig 4C～4E所示，与对照组相比，亚硒酸钠各组MDA含量均明显升高(P<0.01)，亚硒酸钠组SOD、GSH含量明显减少(P<0.01)。

2.5亚硒酸钠对Keap1/Nrf2/ARE信号通路的影响如Fig 5所示，经过亚硒酸钠处理的A549细胞，其Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达明显下降，蛋白的表达量与亚硒酸钠浓度呈负相关，这也是亚硒酸钠促进人肺腺癌A549细胞凋亡的重要原因。提示亚硒酸钠通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路，诱导A549细胞发生凋亡。

2.6亚硒酸钠对Nrf2在细胞质和细胞核中表达的影响如Fig 6所示，随着亚硒酸钠浓度的升高，A549细胞胞核中Nrf2蛋白表达明显下降，细胞质中Nrf2蛋白表达明显上升，并且存在浓度依赖性。说明亚硒酸钠抑制Nrf2从细胞质中迁移至细胞核，从而抑制Nrf2入核与下游的多效应靶基因ARE结合，使转录产物包括SOD、HO-1等多种抗氧化酶的表达降低，这与Fig 5结果相一致。因此，亚硒酸钠诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的机制与Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关，同时可以抑制Nrf2发生核移位。

3 讨论

肺癌是高发病率、高死亡率、预后最差的恶性肿瘤之一，严重威胁着人们的健康[8]。目前，临床上的抗肿瘤药物多数表现为价格昂贵、毒副作用大等缺点[9]，因此，寻找高效并且低毒的抗肿瘤药物将成为国内外研究的重点。硒是动物的必需矿物质元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的组成成分之一，可以保护细胞膜免受过氧化物的损害，作为自由基的捕获剂，能够防癌治癌，参与辅酶A和辅酶Q的生物合成过程，促进丙酮酸脱羧反应的进行[10]。除此之外，硒与许多生理生化过程密切相关，包括氧化还原稳态的生物合成，跨膜的离子通量调节和角蛋白完整性的维持[11]。

Fig 5 Effects of sodium selenite on protein expressions of Keap1/Nrf2/ARE pathway in A549

**P<0.01vscontrol group

Fig 6 Effects of sodium selenite on cytoplasmic and nuclear protein levels of Nrf2 in A549

**P<0.01vscontrol group

本研究MTT检测显示，亚硒酸钠对人肺腺癌A549细胞的增殖具有抑制作用。通过倒置荧光显微镜对细胞形态学观察、Annexin V-FITC/PI流式分析，证实了亚硒酸钠具有促进人肺腺癌A549细胞凋亡的作用。从以上结果分析，亚硒酸钠可能通过对人肺腺癌A549细胞生长的抑制作用，促进细胞凋亡。

氧化应激相关的实验结果提示，亚硒酸钠可能通过消耗A549细胞中的SOD和GSH含量，降低其抗氧化能力，诱导A549细胞发生氧化应激反应，同时产生大量的ROS，导致细胞MDA含量增加，从而抑制了人肺腺癌A549细胞增殖。说明亚硒酸钠对人肺腺癌A549细胞的杀伤能力与细胞内氧化应激反应之间存在一定的相关性。

Keap1/Nrf2/ARE信号通路是迄今为止最重要的抗氧化通路[12]，参与体内氧化应激反应[13]。Nrf2与Keap1解离后进行活化，活化后的Nrf2进入细胞核内，与ARE相结合，启动下游Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白类、蛋白酶体以及泛素酶的基因表达[14]。Western blot结果显示，亚硒酸钠下调人肺腺癌A549细胞中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达，并且随着亚硒酸钠浓度的增加，Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的表达降低。同时细胞核中Nrf2蛋白表达随着亚硒酸钠浓度的增加而降低，而细胞质中Nrf2蛋白表达与其相反。这说明亚硒酸钠致人肺腺癌A549细胞的凋亡可能与Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关，并且该通路发挥作用的机制可能与亚硒酸钠抑制Keap1/Nrf2/ARE中Nrf2发生核转位密切相关。

综上所述，亚硒酸钠通过抑制人肺腺癌A549细胞增殖，诱导细胞凋亡，调节细胞内氧化应激反应，调控Keap1/Nrf2/ARE抗氧化信号通路，从而促进人肺腺癌A549细胞凋亡，这对亚硒酸钠在肿瘤防治方面的研究具有重要的指导意义。此外，本研究初步探索了亚硒酸钠诱导人肺腺癌A549细胞凋亡的作用及可能的分子机制，以期为亚硒酸钠临床用药提供可靠的理论基础和实验依据。