小分子阿胶抗疲劳、抗氧化及止血作用研究

姜一朴，邸志权，王延涛，安梦培，胡金芳，金 涌，张宗鹏，张 淹

(1. 安徽医科大学药学院，安徽 合肥 230032；2. 天津药物研究院新药评价有限公司，天津 300301；3. 东阿阿胶股份有限公司国家胶类中药工程技术研究中心，山东 聊城 252201)

阿胶(AsiniCoriiColla)是由马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶，具有滋阴润肺、补血止血等功效，与人参、鹿茸并称为“中药三宝”[1]。其成分中蛋白质含量较高(约80%)，相对分子质量集中在6×103～2×105u，现代研究表明，相对分子质量过大会影响吸收入体或生物利用度较低，这一定程度上印证了阿胶“滋腻碍胃”的特性[2-3]。据研究，将大分子阿胶经仿生酶解或者仿生消化得到小分子低聚肽，其具有提高免疫力的作用，并有明显的补血升白作用[2,4-5]。小分子阿胶为阿胶水解物，分子量的减小使得其服用后更易被机体吸收利用，避免了因分子量大而影响药效发挥的弊端。本研究参考阿胶的药理作用，旨在探究小分子阿胶的抗疲劳、抗氧化及止血作用，为其工艺改进提供一定的理论依据。

1 材料

1.1实验动物ICR小鼠，SPF级，♂ ♀各半，体质量(19±1)g；SD大鼠，SPF级，♂ ♀各半，体质量(170±10)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.2仪器ADVIA2120型血液分析仪(Siemens Healthcare Diagnostics Inc.)；ACL9000型凝血分析仪(Instrumentation Laboratory Co.)；SHHW21/600A Ⅱ型三用电热恒温水箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；ST 16R型离心机(Thermo Fisher Scientific Inc.)。

1.3药品与试剂小分子阿胶(small moleculeAsiniCoriiColla，SMACC)：批号1609001，东阿阿胶股份有限公司；生血丸：批号9880013，天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂；乙酰苯肼(acetyl phenylhydrazine，APH)：批号20161104，天津市光复精细化工研究所；环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)：批号16031225，江苏恒瑞医药股份有限公司；安琪高活性干酵母：生产日期20160810，安琪酵母股份有限公司；肝素钙注射液：批号55151202，天津生物化学制药有限公司；丙二醛(maleic dialdehyde，MDA，批号20161227)、脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO，批号20161227)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批号20170118)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；血液学检测试剂：SIEMENS ADVIA三合一正常值质控全血(批号72025)、全血细胞计数配套试剂(批号45688)、白细胞分类计数配套试剂(批号54747)，购自SIEMENS公司；凝血功能检测试剂：质控血浆(批号N0942249)、凝血酶原时间(prothrombin time，PT，批号N0696900)、凝血酶时间(thrombin time，TT，批号N0556567)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT，批号N1058925)、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB，批号N0656757)，购自美国实验室仪器公司。

2 方法

2.1剂量设定参考阿胶的用法用量(人的日用量按9 g计)，人体质量按60 kg计，小鼠体质量按20 g计，依体表面积换算成小鼠的等效剂量为1.70 g·kg-1，依此进行预实验后，本研究将小分子阿胶的小鼠剂量设置为3.00、1.50、0.75 g·kg-1，大鼠剂量设置为1.500、0.750、0.375 g·kg-1。

2.2实验动物分组及给药动物随机分为6组，分别为对照组、模型组、阳性药组(生血丸：大鼠1.500 g·kg-1; 小鼠3.00 g·kg-1)、小分子阿胶高、中、低剂量组。采用灌胃法，各组按大鼠10 mL·kg-1，小鼠20 mL·kg-1每天给药1次，对照及模型组给予等量去离子水，连续14 d。

2.3对复合血虚模型大鼠的影响参考文献[6]方法，选用SD大鼠，于给药d 8，除对照大鼠外，腹腔注射APH 30 mg·kg-1；于d 12，腹腔注射APH 60 mg·kg-1、CTX 100 mg·kg-1，给药结束于d 15，将大鼠放入冰水中游泳计时，记录大鼠的力竭时间(上下沉浮多次为限)，随后麻醉大鼠，腹主动脉采集EDTA抗凝血用于血液学检查，采集促凝血，离心获得血清，检测SOD、MDA、LPO。

2.4对小鼠出血、凝血时间的影响选用ICR小鼠(无模型组)，于d 14给药1 h后，毛细管法测定凝血时间(clotting time，CT)，剪尾法测定出血时间(bleeding time，BT)。计算改善率：改善率=(给药组时间-对照组时间)/对照组时间×100%。

2.5对血热复合出血模型大鼠的影响参考文献[7]方法，选用SD大鼠，于给药d 14，除对照大鼠外，皮下注射质量分数为20%的酵母混悬液10 mL·kg-1，5 h后灌胃给药，1 h后灌胃给予1 mL无水乙醇，给药结束于d 15麻醉大鼠，腹主动脉采血，检测血浆TT、APTT、PT、FIB，并进行血液学检查。

2.6对肝素化出血模型大鼠的影响参考文献[8]方法，选用SD大鼠，d 14末次给药后，皮下注射肝素钙300 U·kg-1复制出血模型，1 h后麻醉大鼠，腹主动脉采血，检测血浆TT、APTT、PT、FIB。

3 结果

3.1SMACC对复合血虚模型大鼠的影响与对照组比较，模型大鼠体质量明显下降(P<0.05)，游泳力竭时间明显缩短(P<0.01)，血清中抗氧化成分SOD活性明显降低(P<0.01)，氧化产物MDA、LPO含量明显升高(P<0.01)，白细胞(white blood cell，WBC)计数、淋巴细胞(lymphocyte，LYM)数量、红细胞(red blood cell，RBC)计数、血红蛋白(hemoglobin，HGB)浓度、红细胞比容(hematocritg，HCT)均明显降低(P<0.01)。相比于模型组，小分子阿胶1.500、0.750、0.375 g·kg-1有效延长大鼠游泳力竭时间(P<0.05，P<0.01)，降低血清中MDA、LPO含量(P<0.05，P<0.01)，1.500、0.375 g·kg-1剂量组LYM数量明显增加(P<0.05)。见Fig 1、2，Tab 1。

Fig 1 Effect of SMACC on body weight and exhausted timein rats with complex blood

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of SMACC on serum SOD，MDA and LPO in rats

**P<0.01vscontrol;#P<0.05，##P<0.01vsmodel

Tab 1 Effect of SMACC on hematological indicators in rats with complex blood

**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsmodel

Tab 2 Effect of SMACC on coagulative function in fevered and bleeding

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effect of SMACC on hematological indicators in fevered and bleeding

*P<0.05，**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.2SMACC对小鼠出血、凝血时间的影响如Fig 3所示，相比于对照组，小分子阿胶3.00、1.50 g·kg-1明显缩短CT、BT，差异有统计学意义(P<0.05)。

Fig 3 Effect of SMACC on clotting time and bleeding time

*P<0.05vscontrol

3.3SMACC对血热复合出血模型大鼠的影响Tab 2、3结果显示，与对照组相比，模型大鼠PT、APTT明显延长(P<0.01)，TT缩短(P<0.01)，FIB水平明显增加(P<0.01)，WBC、LYM、血小板(blood platelet，PLT)数量明显降低(P<0.01)。与模型组比较，小分子阿胶1.500 g·kg-1对PT具有明显缩短作用(P<0.05)，增加FIB水平(P<0.01)；1.500、0.750 g·kg-1剂量组WBC、LYM、RBC、HGB、HCT均明显升高(P<0.01，P<0.05)，1.500、0.375 g·kg-1剂量组PLT升高(P<0.01)。

3.4SMACC对肝素化出血模型大鼠的影响对照组大鼠PT、APTT、TT均明显延长，其中TT、APTT、FIB超过仪器检测限值。与对照组比较，小分子阿胶各剂量组对APTT、TT、FIB无明显影响，仍在仪器检测限值之外，结果不做统计。小分子阿胶1.500 g·kg-1明显缩短PT(P<0.01)，见Fig 4。

4 讨论

APH具有强氧化作用，通过干扰RBC内的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，引起RBC破坏、HGB减少等溶血性贫血。CTX是一种细胞毒制剂，也是一种免疫抑制剂，不仅对机体的免疫器官有损伤作用，也对增殖周期中各期细胞具有杀灭作用，使骨髓造血功能抑制，从而使动物表现出血虚证状。APH与CTX联合，经两个途径共同造成动物血虚，使各类细胞数量全面下降，免疫器官受到损伤[9-10]。血虚状态下供血不足或血液的濡养功能减退，表现为全身虚弱证候，由于缺血缺氧降低了机体的新陈代谢，能量减少，因此显示出大鼠游泳时间缩短、体温下降等一系列气虚状态[11]。氧自由基增多是机体疲劳主要表现之一，血虚大鼠进行游泳实验时，机体内一系列氧自由基代谢会发生改变，表现为抗氧化能力的下降和脂质过氧化反应的增强[12]。SOD是机体清除氧自由基的重要酶，MDA、LPO是自由基引起的脂质过氧化的主要产物，它们的活性和含量间接反映机体的抗氧化能力，同时，也能间接反映机体的疲劳状态。

Fig 4 Effect of SMACC on coagulative functionin heparinized bleeding

**P<0.01vscontrol

血虚大鼠游泳体力耗竭时间的明显延长，血清中氧化产物MDA、LPO含量的明显降低，表明小分子阿胶能够增强大鼠耐力，具有抗疲劳及抗氧化的能力。血中LYM数量呈现明显增加，考虑小分子阿胶作用机制可能是通过清除自由基，保护细胞膜或加快抗氧化物合成代谢的方式，来提高机体应对氧化应激状态的能力，提高机体免疫力，增强大鼠对APH和CTX毒性的抵抗能力，发挥抗氧化及抗疲劳作用。

小鼠断尾出血时间(BT)和毛细管凝血时间(CT)实验广泛用于中药止血、促凝血的活性筛选，综合反映参与止血过程的血管、血小板、凝血系统等多种因素的功能[13]。本研究中，给药小鼠BT、CT明显缩短，表明小分子阿胶能够促进血液凝固、加快伤口的止血速度，对外伤所致的出血情况具有较好的止血功效。

血液凝固是一个多系统参与的复杂过程，是由一系列凝血因子参与的酶促过程，包括内源性、外源性凝血途径及纤溶系统。PT是外源性凝血途径的常用实验指标，反映了外源性凝血系统各因子的活性及是否正常；APTT主要反映内源性凝血因子的活性和含量的变化；TT反映的是内、外源性共同凝血系统；FIB主要反映是否有足够的纤维蛋白原来生成纤维蛋白；PLT在血液凝固过程中发挥着重要作用，它的黏附、聚集、释放起到止血作用，同时它还为各种凝血酶原的活化提供必需的磷脂膜[14]。本研究酵母致血热出血模型以及肝素化出血模型中，均仅见小分子阿胶对PT有明显影响，结果一致，相互印证，提示小分子阿胶的止血作用机制可能在凝血级联反应上游，仅对外源性凝血途径具有激活作用，其作用靶点可能在凝血因子Ⅲ的激活过程。另外，小分子阿胶也通过增加FIB含量，促进纤维蛋白原转变为纤维蛋白的过程，升高大鼠血中PLT数量，影响抗凝和纤溶系统起作用。

干酵母诱导血热复合出血模型中，观察到RBC、HGB水平明显升高，虽未见模型组指标有明显异常，但仍说明在某些机制下，小分子阿胶具有“升红”作用，推测耗氧量增加可能是模型形成的机制之一，小分子阿胶具有抗氧化的作用，从而提高了RBC、HGB水平。小分子阿胶逆转WBC、LYM等血液学指标的不良改变，提示其可能具有一定的“升白”作用，其具体“升红”“升白”作用及机制有待进一步深入研究。

综上研究结果表明，小分子阿胶具有抗疲劳、抗氧化、增加耐力的作用，同时具有止血收敛的作用，将阿胶水解制得小分子阿胶的工艺改进具有可行性。

(致谢: 本实验于天津药物研究院新药评价有限公司实验室完成，在此对本实验做出贡献的所有人员给予诚挚的感谢。)