Akt对IL-1β诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经元的作用

种 堔， 董美希， 刘 莹， 范国兵， 张敏娜， 王光辉， 吴景龙

帕金森病(parkinson’s disease，PD)为ROS氧化应激损伤和炎症因子的释放等选择性的造成中脑部位多巴胺能神经元变性丧失的一种神经退行性疾病。临床治疗常用左旋多巴、苯海索等药物，不良反应较重且需长期服药。利用干细胞增殖、定向分化和趋化性迁移等生物学属性[1～3]，有望分化形成多巴胺能神经元，取代帕金森病等神经退行性疾病变性、坏死的神经元。相关研究发现胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、神经干细胞和肾上腺髓质嗜铬细胞瘤来源的未分化型PC12细胞等神经元前体细胞都具备多巴胺能神经元分化潜能[4～8]，分化为成体细胞参与替代和修复受损的神经组织。诱导分子及其信号通路对分化细胞的表型作用是探索以上各类干细胞分化机制的关键，目前这方面报道较少。本研究通过IL-1β对大鼠神经干细胞(neutral stem cells，NSCs)诱导分化，探寻蛋白激酶B/Akt信号通路磷酸化与NSCs分化为多巴胺能神经元表型的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂、主要仪器和图像分析软件 新生24 h Wistar大鼠培养自济宁医学院实验动物中心，动物处置符合相关伦理学要求，实验动物使用许可证编号SYXK(鲁)20180002。细胞培养基DMEM/F12(1∶1)和B27神经细胞生长添加剂、青霉素及链霉素(Gibco 公司，美国)，胎牛血清FBS(四季青公司，杭州)、EGF、IL-1β和bFGF(Peproetch 公司，美国)，多聚赖氨酸和胰蛋白酶、TH(tyrosine hydroxylase) 抗体(Sigma 公司，美国)，βⅢ-Tubulin(human) mAb(TU-20)来自Alexis公司，anti-phospho-Akt抗体、NSE Antibody(PA1-21081)、GFAP抗体、大鼠来源的nestin抗体来自Cruz Biotechnology公司，图像分析软件Motic Digital Class 1.1 /Motic Images Advanced 3.1来自美国Motic公司、解剖显微镜、IX71相差显微镜来自Olympus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 NSCs原代培养 清洁级24 h新生幼鼠断颈法处死后消毒15 min。无菌操作沿颅骨缝剪开 “人”字形切口，取脑组织约5 mm×5 mm×5 mm大小(中脑腹侧部位)，D-Hanks 液浸洗后转移到预冷D-Hanks 液内，分离脑膜，充分游离脑膜附着血管。D-Hanks 液再次浸洗3～5次。胰酶经5%CO237 ℃恒温条件下消化15 min，轻柔吹打300次，400目滤网滤过后收集滤液离心镜下计数后接种至无血清细胞培养基DMEM/F12、B27添加物、表皮细胞生长因子(EGF)、青霉素链霉素培养液内，接种密度1×105个/ml，培养条件为37 ℃ 5%CO295%饱和湿度恒温培养。每3～4 d换液1次，每7 d计数传代1次。

1.2.2 NSCs生物学属性鉴定 nestin蛋白检测：细胞离心机涂片后4%多聚甲醛固定30 min，行细胞免疫荧光检测。nestin抗体工作液浓度为1∶800，封片后在荧光显微镜下观察和拍照。分化能力检测：1×105/ml接种至无血清细胞培养基DMEM/F12、B27添加物，特别加入10% FBS，分化7 d后行4%多聚甲醛固定30 min，细胞免学检测GFAP和NSE。

1.2.3 IL-β诱导NSCs分化与免疫学检测 取第3代培养细胞以1×105/ml密度接种48孔板内，每孔1 ml。设立10%FBS对照组，实验组分别为A组IL-1β 40 pg/ml、B组80 pg/ml、C组120 pg/ml和D组160 pg/ml。至3.5 d半量换液，分化7 d后中止诱导，重复3组。分化7 d后中止诱导后免疫荧光检测，随机取6个视野，统计βⅢ-tubulin和TH表达。阳性率计算方法为细胞阳性率=阳性细胞数/DAPI阳性细胞数，重复3次实验，取平均值记录。图像分析软件Motic Digital Class 1.1 /Motic Images Advanced 3.1测量多巴胺能神经元突起，随机记录荧光显微镜高倍镜视野突起总长度数值。

1.2.4 免疫印迹分析 浓度设置为120 pg/ml IL-β诱导NSCs 60 min、120 min、180 min和240 min。10%FBS诱导组为对照。终止诱导后，裂解液RIP 1 ml和PMSF10 μl分解分化细胞，超声粉碎离心取上清液，加入蛋白上样缓冲液，100 ℃10 min后，取10 g加载到10%的SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳分离结束后将蛋白转至PVDF膜，时间90 min，5%脱脂奶粉封闭60 min，加入山羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶室温下孵育，2 h后加入抗磷酸化Akt抗体(1∶20000)，条件为4 ℃过夜，隔日取出，室温放置60 min，TBST冲洗膜3次，ECL暗室曝光，软件扫码条带灰度。β-actin 为内参，计算磷酸化的蛋白激酶B/Akt表达情况。

2 结 果

2.1 NSCs培养和鉴定 原代培养细胞经24 h形成神经球群落，如图1A所示，每个神经球约有30～60个椭圆形或圆形分化细胞聚集形成；制成单细胞悬液，进行免疫荧光染色，nestin蛋白在细胞质中表达，如图1D所示胞浆呈鲜红荧光者即为阳性细胞；血清分化后如图1B所示，细胞发出2～5个突起，随时间增加，长度延长，末端见树突棘；诱导72 h如图1C所示突起之间连接成网状。细胞铺片免疫学检测如图1E和1F所示，NSE和GFAP在分化细胞中表达。

2.2 IL-1β诱导NSCs分化 设置10%FBS 为对照组、实验组分A组IL-1β 40 pg/ml、B组IL-1β 80pg/ml、C组IL-1β 120 pg/ml和D组IL-1β 160 pg/ml，诱导14 d后检测β-tubulinⅢ表达、TH的表达和神经突起长度，结果(见表1)。

2.3 IL-1β对NSCs分化过程Akt磷酸化的影响 设置IL-1β 120 pg/ml为实验组进行诱导神经干细胞，10%FBS为对照组。实验各组分别取60 min、120 min、180 min和240 min 四个诱导时间段，Western blot分析结果显示实验各组与10%FBS对照组比较，Akt磷酸化水平升高的时间为诱导60 min(P<0.01)、120 min(P<0.01)和180 min(P<0.05)，诱导240 min时AKT磷酸化水平二者相比差异不明显(P>0.05)(见图2)。

A：细胞克隆增殖聚集形成神经球(×400)；B：10%FBS 24 h神经突起开始出现(×100)；C：10%FBS 72 h神经突起延长并且相互连接形成突触状结构(×100)D：免疫荧光显示神经球细胞Nestin表达(SP×400)；E：免疫细胞化学显示分化细胞NSE表达(SP×400)；F：免疫细胞化学显示分化细胞GFAP表达(SP×400)

IL-1β120 pg/ml诱导NSCs后分化细胞半定量分析磷酸化Akt表达结果，与10%FBS对照组比较P<0.01(60 min)，P<0.01(120 min)，P<0.05(180 min)，P>0.05(240 min)

表1 NSCs诱导分化结果

3 讨 论

从神经系统胚胎发育过程的相关研究中发现中脑多巴胺能经元神经元的分化过程涉及多种信号通道及细胞外信号分子、调控蛋白分子以及相关基因。Shabana[9]和Vukasin等[10]研究发现骨形成蛋白BMP/SMADs途径激活后的神经干细胞进一步通过调节MSX1/2基因和SHH基因的表达，使多巴胺能神经元的分化表型明显增加。另据研究显示大脑发育形成过程中，来源于不同部位的神经前体细胞基因表型有所差异，GABA能神经元主要表达在前脑部位，而中脑是以多巴胺能神经元明显占优势，这种调控可能与锌蛋白ZINC1和ZINC2参与分化平衡调控相关[11]。Varshneyd等[12]通过动物实验研究发现雌激素受体β(ER-β)诱导神经前体细胞发育为多巴胺能神经元过程中通过Notch信号的激活发挥了关键作用，其研究结果表明激素及其受体参与了神经元的迁移和分化表型调控。各种细胞外信号分子的诱导下，尤其在低氧环境下，多巴胺能神经元表型分化相关编码基因被激活，胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)、白细胞介素、脑源性神经营养因子(brain derived neuotrophic factors，BDNF)为NSCs分化为多巴胺能神经元提供体外分化信号[13～15]。本实验中培养神经干细胞原代取材于幼鼠中脑部位，通过神经球悬浮法培养和及时传代获得有效的增殖细胞群落。中脑神经元分化过程中借助锌蛋白ZINC1和ZINC2等参与表型分化平衡调控，保证了多巴胺能神经元基因表型的优势。IL-1β作为信号分子诱导神经干细胞分化过程中神经细胞标志物β-tubulinⅢ蛋白表达以及酪氨酸羟化酶TH分化细胞(多巴胺能神经元)表达增加，进一步研究发现巴胺能神经元突起的长度随着IL-1β浓度增加而上增加，呈现浓度依赖性。本实验证实IL-1β是NSCs向多巴胺能神经元表型分化过程中关键的细胞外信号分子。

Akt作为一种靶蛋白(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)位于PI3K(磷酸肌醇3激酶)下游，构成PI3K/Akt信号传导通路的关键部分，包含氨基PH 结构域(位于末端)、调节结构域(位于碳末端)和催化结构域(中心位置，丝氨酸/苏氨酸)三部分。Akt根据结构和功能的差异分为Akt1、Akt2和Akt3 3种不同功能亚型，Akt1控制细胞增殖，Akt2与细胞迁移相关，Akt3决定细胞分化表型。Akt经磷酸化修饰后被激活后，继而呈现瀑布式激活下游级联信号系统以及多个靶分子位点，主要包括核转录因子NF-κB、caspase以及促凋亡蛋白Bad等，增强细胞代谢、促进增殖发育、抑制细胞凋亡程序的激活等生理作用[16～18]。研究表明缺氧条件下、BDNF脑源性神经营养因子和血管源性神经营养因子等细胞因子通过磷酸化激活PI3K/Akt信号通路介导了NSCs自我复制增殖和神经元方向的定向分化[19，20]。本实验研究发现中IL-1β诱导后Akt 的磷酸化水平显著升高，尤其是诱导后60 min 和120 min 磷酸化水平明显升高，过后随着时间延长表达水平降低。本研究提示Akt 磷酸化修饰可能参与细胞外信号分子IL-1β对NSCs分化调节过程，通过上调磷酸化Akt的表达促进NSCs向多巴胺能神经元表型转化。