Aβ寡聚体损伤PC12细胞毒性研究

梁晓婷， 张丹丹， 梁文昭， 邵延坤， 闫亚韵

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种慢性进展性中枢神经系统退行性疾病。随着人口老龄化的日益严重，患病率也随之增加，成为威胁人类健康的重大杀手，是严重的社会和医疗问题[1，2]。目前认为β淀粉样蛋白(β-Amyloid，Aβ)异常沉积可能是诱发AD形成的关键因素。其中，Aβ42较Aβ40疏水性强，有更强的毒性及自我聚集活性，易形成不可溶的Aβ纤维体导致老年斑形成。早老素1(Presenilin1，PS1)为淀粉样前体蛋白APP分解为Aβ的关键酶γ分泌酶的主要成分。自噬在AD等神经退行性疾病的发生、进展过程中起着核心作用。目前认为纤维状Aβ毒性不如可溶性Aβ寡聚体，可溶性Aβ寡聚体是产生神经毒性作用的重要来源。但体内获得可溶性Aβ很难，使其在体内聚集环境很难实现。所以，本研究通过Aβ寡聚体构建体外AD模型，探讨Aβ寡聚体对于细胞活力、凋亡、Aβ42及PS1表达、自噬等方面的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 未分化的半悬浮PC12细胞购自北京中国科学院细胞库；Aβ42单体、Aβ40单体购自Anaspec；CCK-8试剂盒购自东仁化学科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Bioteke；caspase-3、Beclin 1、PS1 antibody购自Anaspec；羊抗鼠IgG-HRP购自MILLIPORE。电泳仪、转移槽为BIORAD；酶标仪(BIOTEK)。

1.2 方 法

1.2.1 Aβ寡聚体的制备及CD谱分析 将Aβ40及Aβ42单体各取5 mg分别放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，该步在冰上进行，盖上离心管盖60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分装每管100 μl，室温使在冰上预冷的HFIP挥发，将干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用时肽膜放在冰上，每管在超净台中加DMSO充分溶解，使终浓度为5 mmol/L，吹打混匀，加无酚红的DMEM培养基，尽量不要超过100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，离心取上清液，放入-80 ℃冰箱。取制备的Aβ寡聚体，委托中科院大分子国家重点实验室进行CD谱分析。

1.2.2 Aβ42与Aβ40混合物寡聚体的制备 将Aβ40及Aβ42单体各取5 mg分别放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，该步在冰上进行，盖上离心管盖60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分装每管100 μl，按摩尔量比例为1∶9，3∶7，4∶6，1∶0，4∶0，10∶0将Aβ42与Aβ40混合到新的EP管中，保证终浓度为1 mmol/L。室温使在冰上预冷的HFIP挥发，将干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用时肽膜放在冰上，每管在超净台中加DMSO充分溶解，使终浓度为5 mmol/L，吹打混匀，加无酚红的DMEM培养基，尽量不要超过100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，离心取上清液，放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 细胞培养及Aβ损伤PC12细胞AD模型制备 将未分化的半悬浮PC12细胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内孵育，按1∶4～1∶3进行细胞传代，第10～30代的分化细胞，以2×104密度接种到6孔板中，用于AD模型的制备，将1.2.2中制备的浓度为100 μmol/LAβ混合物寡聚体加到培养基中，37 ℃孵育24 h后进行实验。

1.2.4 CCK-8检测 生长良好的PC12细胞每孔8000～10000个接种于96孔板上，长满后加不含血清的DMEM高糖培养基培养，24 h后加入10 μmol/L 的Aβ混合物寡聚体，作用24 h后弃上清液，每孔加入200 μl培养基及20 μl CCK-8试剂避光孵育，酶标仪测定1 h后450 nm处OD值，重复3次。

1.2.5 ELISA法检测Aβ损伤PC12细胞Aβ42的表达 Aβ寡聚体损伤后的PC12细胞经细胞裂解液RIPA裂解、离心后取上清移入新的EP管，制备总蛋白。用酶联免疫吸附实验双抗夹心法检测Aβ42的表达，具体方法按说明书。

1.2.6 Western blot 检测Aβ损伤PC12细胞caspase-3、PS1、Beclin 1的表达 同1.2.5制备总蛋白，BCA法测蛋白浓度、 SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，脱脂奶粉封闭，一抗稀释比例1∶1000，孵育 4 ℃ 过夜，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)稀释比例1∶2000，37 ℃孵育1 h。在暗室曝光显影。用Image J 图像处理软件分析目标条带的光密度，求目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值。

1.2.7 免疫组化检测Aβ损伤PC12细胞PS1表达 血清封闭，一抗(PS1 antibody)稀释比例1∶200，4 ℃过夜孵育，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)孵育，37 ℃，DAB染色，封片剂封片，显微镜下观察。

1.3 统计学方法 SPSS17.0统计，各组数据间进行t检验分析，当P<0.05时，认为具有统计学意义。

2 结 果

2.1 Aβ42 CD谱分析 用圆二色谱仪对各点聚合的Aβ42分析，用在线软件计算α-螺旋、β折叠、无规卷曲的含量，发现3 h和12 h二级结构几乎无改变，24 h二级结构β折叠升高，48h其β折叠降低。提示Aβ42寡聚体聚合24h进行实验的意义较大。

2.2 CCK-8检测Aβ损伤PC12细胞活力 Aβ寡聚体混合物总量相同时，Aβ42/Aβ40不同比例损伤PC12细胞时，比值微小变化(3 μmol/L∶7 μmol/L到4 μmol/L∶6 μmol/L)时，PC12细胞活力增加(a：P<0.05)，但Aβ42的含量为10 μmol/L，PC12细胞的活力表现为下降(b：P<0.05)，说明在一定浓度范围内Aβ寡聚体可以使PC12细胞活力增强，并且与Aβ42的含量相关，超过一定范围后活力下降。Aβ42蛋白的含量相同时，Aβ42蛋白的浓度增加(1 μmol/L～4 μmol/L)时，PC12细胞的活力增加(c：P<0.05)，且具有剂量依赖性(见图1)。

2.3 Aβ损伤PC12细胞Caspase 3表达 Aβ寡聚体总量相同时，4∶6组，与1∶9组、3∶7组相比，caspase-3的表达增多，且差异有统计学意义(a：P<0.05)，Aβ寡聚体中Aβ42含量相同时，Caspase 3表达增加，差异有统计学意义(b：P<0.05，c：P<0.05)，Aβ42/Aβ40比值为4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)组比1∶0(1 μmol/L∶0 μmol/L)组caspase-3表达增加，有统计学差异(d：P<0.05)。说明Aβ寡聚体损伤PC12细胞引起细胞凋亡，Aβ42比例越大，凋亡越明显，且具有剂量依赖性，Aβ40可以减轻Aβ42引起的细胞凋亡，对细胞起保护作用。综上，通过不同比例Aβ42/Aβ40混合物寡聚体损伤PC12细胞，能够在体外模拟AD的病理过程，成功建立了PC12细胞AD模型(见图2)。

(A)a示与1∶0组相比，P<0.05，b示与4∶0组相比，P<0.05。(B)Pure示只有Aβ42，Mix示Aβ42与Aβ40混合物，a示与Mix组相比，P<0.05，b示与Mix组相比，P<0.05，c示与1∶0组相比，P<0.05。(C)a示与1∶0组相比，P<0.05，b示与4∶0组相比，P<0.01

(A)β-actin为内参；(B)a示与1∶9组相比，P<0.05，b示与1∶9组相比，P<0.05，c示与4∶6组相比，P<0.05，d示与1∶0组相比，P<0.05

2.4 Aβ损伤PC12细胞Aβ42的表达 ELISA法检测示在一定浓度范围内，Aβ寡聚体混合物总量相同时，Aβ42/Aβ40不同比例损伤PC12细胞时，当比值微小变化时，Aβ42的表达量显著且比值越大，Aβ42表达量越高，具有统计学意义(b：P<0.05)。说明Aβ寡聚体混合物损伤PC12细胞Aβ42的聚集与Aβ寡聚体混合物中Aβ42的比例显著相关。单纯的Aβ42寡聚体与Aβ42与Aβ40混合物对比，当两者Aβ42含量相同，单纯的Aβ42寡聚体引起Aβ42表达增加，且具有剂量依赖性(c：P<0.01)，说明Aβ40可以减少Aβ42的表达，对细胞有保护作用(见图3)。

(A)a示与1∶9组相比P<0.05，b示与3∶7组相比P<0.05，c示与4∶6组相比P<0.01。(B)a示与1∶9组相比P<0.05，b示与4∶6组相比P<0.05，c示与1∶0组相比，P<0.01

2.5 Aβ损伤PC12细胞PS1的表达 Western blot检测结果示：Aβ寡聚体总量相同时，PS1的表达差异不明显，Aβ42/Aβ40比例为10∶0时与4∶6(4 μmol/L：6 μmol/L)组，PS1的表达并不增加，但4∶6组与1∶9组、3∶7组相比，PS1的表达增多，且差异有统计学意义(a：P<0.05，b：P<0.05)，表明AD的发病过中，Aβ40含量在一定程度的减少可激活PS1的表达。单纯的Aβ42寡聚体与Aβ42与Aβ40混合物对比，当两者Aβ42含量相同，PS1的表达差异没有统计学意义(b：P>0.05)(见图4)。

2.6 Aβ损伤PC12细胞Beclin 1的表达 Aβ混合物寡聚体中Aβ42/Aβ40比例变化时，Aβ42/Aβ40值4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)组、4：0组比1∶9组Beclin 1的表达增加；Aβ42含量相同时，Aβ42/Aβ40从1∶9(1 μmol/L∶9 μmol/L)到1∶0、从4∶6到4∶0，Beclin 1的表达显著增加，差异有统计学意义(a：P<0.05，b：P<0.01)，说明Aβ42可以激活自噬，且自噬的强弱与Aβ42在寡聚体中的含量相关，具有剂量依赖性(e：P<0.05)。当Aβ42/Aβ40的比值为10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)，Beclin 1的表达明显降低，自噬受到抑制，说明Aβ42对细胞自噬的激活在一定的浓度范围内有效，当浓度过大时，细胞自噬减弱，引起细胞损伤(见图5)。

(B)a示与1∶9组相比，P<0.05，b示与3∶7组相比，P<0.05。(C)a示与1∶9组相比，P<0.05，b示与1∶0组相比，P>0.05，差异无统计学意义

(A)β-actin为内参；(B)a示与1∶9组相比，P<0.05，b示与4∶6组相比，P<0.01，c示与1∶0组相比，P<0.05，d示4∶0组相比，P<0.01，e示于1∶0组相比，P<0.05

3 讨 论

Aβ蛋白是由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)裂解产生的，不同个体内有不同的Aβ蛋白的谱系，表现为Aβ1～43、Aβ1～42和Aβ1-40不同比例的混合。正常人体内大约90%为Aβ40，只有少数为Aβ1～43、Aβ1～42。尽管这些β淀粉样蛋白只有几个氨基酸的差异，但功能却相差很远。Schellenberg等[3]于1992 年首次发现PS-1 基因与家族性AD发病有关，PS1属于进化过程中非常保守的蛋白质，主要表达于大脑新皮质、海马。PS1在生物体中有重要作用，在APP及Notch1蛋白的水解过程中扮演着重要角色。目前认为，PS1参与形成γ分泌酶复合物来调节Aβ的生成。γ分泌酶复合物由PS、Nicastrin、APH1和PEN2构成，PS1是γ分泌酶复合物的活性中心。自噬能清除受损细胞器及异常折叠的蛋白质，目前研究认为自噬是可以减轻神经毒性及清除神经元内异常沉积的Aβ的潜在治疗靶点。自噬囊泡在AD小鼠脑中大量积聚可使轴突受损[4]。Beclin 1是细胞自噬的关键调控因子，与配体结合，调节细胞内自噬的活性[5]。

为成功建立Aβ损伤的PC12细胞AD细胞模型，Aβ标本中β片层结构的含量为制备的关键因素。因为生理状态下Aβ是可溶性的α螺旋结构，病理状态下Aβ为容易形成纤维状或沉积的β片层结构。在病理状态下Aβ自发快速形成β片层结构，进而形成纤维、沉积发挥毒性。Aβ寡聚体比纤维状的Aβ毒性更强，且其毒性依赖于形成β片层结构的能力[6，7]。本研究应用体外制备的Aβ寡聚体损伤PC12细胞，同时检测Aβ寡聚体聚合不同时间点β片层结构的含量，研究结果显示Aβ寡聚体聚合24 h含量最高，故选用聚合24 h的Aβ寡聚体制备AD模型。用CCK-8检测细胞活力、Western blot测凋亡相关蛋白caspase-3表达鉴定PC12细胞AD模型，通过不同Aβ42寡聚体与Aβ40寡聚体的混合物比例损伤PC12细胞，说明在一定的浓度范围内(本研究为10 μmol/L)，细胞凋亡率小，细胞的活力增加，研究此阶段的病理及机制可为AD的治疗及预防提供新的靶点。

目前的研究[8，9]结果显示，PS1基因突变可因为改变了γ-分泌酶对APP的剪切位点，使纤维原性较强、易聚集、神经毒性大的Aβ42生成增多从而引发AD。但Aβ损伤细胞后是否影响PS1功能目前少有研究。本研究通过Aβ寡聚体的混合物损伤PC12细胞，观察Aβ对PS1产生的影响，结果发现：Aβ42/Aβ40比例为4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)时与1∶9、3∶7比，Aβ42的表达增加，PS1表达的增加远小于Aβ42的增加，当Aβ42/Aβ40比值由4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)到10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)时，Aβ42表达显著增加，而PS1的表达基本无变化。说明在AD的发病中，Aβ40含量在一定程度的减少可激活PS1的表达，Aβ42含量的增加可明显增加Aβ42的表达，并且具有剂量依赖性，但Aβ42含量增加时PS1表达没有显著变化。研究结果提示，Aβ42/Aβ40比值增加时，可能会引起PS1结构与功能的改变。单粒子电子显微镜及FLIM证实γ分泌酶的成熟体有不同的构象位点[10～12]，在PS1突变的转基因小鼠中发现，PS1与γ分泌酶上紧密结合的区域，可协助长链的Aβ肽段的产生[13]，因此把这个位点称为“closed”，化合物可通过调节PS1向“open”位点发生构象变化就能产生低分子量的Aβ肽段[11，14]。Aβ42含量的增高能够激发PS1向病理位点的构象变化，这一过程通过细胞内的钙超载实现[15]，Aβ42含量的增高引起PS1的改变机制可能与细胞内Aβ42引起的钙超载导致细胞损伤相关[16]。氧化应激及胞内Ca2+的增加可使PC12细胞功能异常的PS1表达增加[17]。另有证据证明：PS可调节细胞内Ca2+的稳态，且不依赖γ-分泌酶的活性[18]。最近的研究做出推断钙超载可能为AD病理生理过程恶化的罪魁祸首[19～21]。

综上，本研究成功模拟了体外AD的病理过程，构建AD早期的细胞模型。并检测了Aβ损伤PC12细胞Beclin 1的表达，结果说明AD的早期阶段一定的浓度范围内Aβ42激活细胞自噬，当浓度过大时，细胞自噬减弱，引起细胞损伤，因此可将此阶段的病理过程作为治疗及预防的靶点。Aβ寡聚体不改变细胞内PS1的含量，可能是通过改变PS1的结构和功能引起Aβ沉积，但Aβ的毒性及机制仍不十分清楚，有待进一步探讨。