齿瓣石豆兰化学成分分离与鉴定

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(1.赣南卫生健康职业学院，江西 赣州 341000;2.江西中医药大学，江西 南昌 330004)

石豆兰属(Bulbophyllum)是兰科(Orchidaceae)树兰族(Trib.Epidendreae) 石豆兰亚族(Subtrrib.Bulbophyllinae)下属之一。该属植物约1 000余种，主要分布于亚洲、美洲、非洲等热带和亚热带地区及大洋洲，大多生长在石灰岩上。我国有98种3变种，主产于长江流域及其以南方各省[1]，如云南、广东、广西、江苏、江西、安徽和湖北，其中云南省最多，有12种。广东省南岭一带有广东石豆兰、圆叶石豆兰、齿瓣石豆兰、密花石豆兰、芳香石豆兰、大苞石豆兰、长足石豆兰、赤唇石豆兰[2]。江西齿瓣石豆兰(Bulbophyllum.levineiSchltr)主要分布于遂川、井冈山等山区。该属植物是常用中草药，常作为药物使用的有广东石豆兰、圆叶石豆兰、齿瓣石豆兰、密花石豆兰、芳香石豆兰、大苞石豆兰、长足石豆兰、赤唇石豆兰，以全草或假鳞茎晒干或新鲜草入药。该属植物味甘辛，性凉，可祛风除湿、凉血活血，主治高热惊风、风湿痹痛、四肢麻木、痈肿、咽痛、跌打损伤[3]，同时还具有养胃生津、祛风除湿、消肿止痛、清热化痰、舒筋骨、滋阴润肺等功效[4-5]。有学者从密花石豆兰全草提取物中发现了具有强烈抑制细胞株作用的成分[6]。本试验对江西赣州产齿瓣石豆兰中的黄酮类成分进行研究，为明确其药理活性物质基础提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器

XPH-300D数码型熔点仪(上海比目仪器厂)；Nicolet 5700 型傅里叶变换红外光谱仪；Inova 500型核磁共振仪(TMS为内标)；Agilent 1100 Series LC/MSD 质谱仪；JASCO P-2000旋光仪；SP-752PC 紫外-可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)；制备液相色谱仪为 Shimadzu LC-6AD (制备柱，YMC-Pack ODS-A，20mm×250mm,5μm)；大孔吸附树脂HP-20(日本三菱公司)；反相硅胶(日本YMC公司)；TE601-L型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；循环水式真空泵(浙江临海市精工真空设备厂)；ZF-I三用紫外分析仪(上海宝山顾村仪器厂)；KQ5200E 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；数显电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；RE-3000B上海亚荣旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 药材与试剂

齿瓣石豆兰样品于2017年9月采自江西赣州，性状特征参照文献[1]描述，经江中药业股份有限公司国家二级技师颜干明鉴定为齿瓣石豆兰。采集到的齿瓣石豆兰用洁净的去离子水清洗干净表面，静置沥干多余的水分后放入75℃ 的电热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。样品自然冷却，粉碎，置于干燥器中保存，备用。凭证样品保存于赣南卫生健康职业学院中药标本室。试验用试剂均为色谱纯或分析纯。

1.3 其他试验用品

硅胶GF254 薄层板(青岛海洋化工有限公司)；柱色谱硅胶G(青岛海洋化工有限公司，200～300目)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(美国 Amersham Pharmacia Biotech 公司)。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

取齿瓣石豆兰全草粉末15 kg，用8倍量水提取3次，每次2 h，合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩，得到浓缩提取物1.4 kg。取提取物1.0 kg，加8倍量95 %乙醇加热回流提取3次，每次2h，提取液旋转蒸发仪减压浓缩，所得流浸膏用水再次搅拌分散，依次用氯仿、甲醇萃取，各萃取液浓缩减压回收溶剂后得浸膏。制得甲醇萃取部位浸膏330 g棕色物，水溶解后用Diaion HP-20型大孔吸附树脂吸附，分别用水、15 %乙醇溶液、45 %乙醇溶液及75 %乙醇溶液洗脱进行层析分离，其中75 %乙醇洗脱部位75 g，经正相硅胶柱色谱，氯仿-甲醇系统梯度洗脱，用500 mL收集瓶收集洗脱液，回收溶剂后用薄层色谱法鉴定，合并相似流份(用相同的展开剂在TCL薄层板上呈现斑点及斑点位移相同流份合并)得到9个(Fr.1～9)不同梯度共130个洗脱流份，见表1。

表1 不同梯度氯仿-甲醇洗脱所得的流份

流份Fr.3-9(3.5g)经反复硅胶柱色谱、氯仿-甲醇系统梯度洗脱，目标成分再经结晶分离得到化合物2(18mg)。流份Fr.5-20(5.2g)经反复硅胶柱色谱、氯仿-甲醇系统梯度洗脱得到化合物1(15mg)。流份Fr.3-12(5.1g)经反复硅胶柱色谱、氯仿-丙酮梯度洗脱得到化合物3(9mg)。流份Fr.6-6(8.3g)经Sephadex LH-20柱色谱分离、甲醇洗脱、反复重结晶得到化合物4(8mg)和化合物5(6mg)。

2.2 结构鉴定

化合物的结构鉴定主要依据其理化性质和波谱数据完成。齿瓣石豆兰主要理化性质包括化合物的性状、熔点及化学特征反应等。波谱数据主要包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、电子轰击离子源质谱(EI-MS)、核磁共振氢谱和碳谱的方法(1H-NMR和13C-NMR)。鉴定结果如下。

化合物1：淡黄色针状，分子式为C17H14O5，mp 138～139 ℃。盐酸-镁粉反应呈阳性，显示为黄酮类化合物。IR (KBr)光谱显示有羟基在3 510cm-1处有最大吸收，在1728cm-1有羰基吸收峰。苯环吸收：1 637、1 598、1 511、1 453cm-1。EI-MS：m/z 299.1 [M+H]+。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：3.75(s,3H,-OCH3)，3.8(s,3H,-OCH3)，6.76(d,2H,H-3',-5')，6.81(d,1H,H-8)，6.84(d,1H,H-7)，7.22(d,2H,H-2',-6')，7.25(s,1H,H-5)，14.1(s,1H,-OH)。在较高场中出现的强s峰结合化学位移和碳谱13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)中所显示的δ55.8 两峰，说明该分子中有两个-OCH3，其质子信为δ3.80 (s,6H)。13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δ： 55.8(2-OCH3)，116.3(C-3',5')，117.3(C-5)，118.9(C-8),128.4(C-2',6')，121.7(C-7)，125.6(C-4)，137.3(C-2)，150.1(C-9)，155.4(C-6)，159.4(C-4')，161.1(C-1)，179.5(C-3,C=O)。以上理化性质和光谱数据与文献[6]报道的基本一致，故鉴定化合物1为6-甲氧基-2-(4'-甲氧基苯基)-3-羟基-色原酮。

化合物2：淡黄色针晶，分子式为C15H10O5，mp 167～168℃。盐酸-镁粉反应呈阳性，显示为黄酮类化合物。薄层色谱以5%FeCl3溶液显色，呈现蓝黑色，显示有酚羟基存在。IR (KBr)光谱在3 295cm-1有羟基的吸收，1 742cm-1处明显C=O吸收。苯环吸收：1 645、1 581、1 509、1 431cm-1。EI-MS：m/z 270.8 [M ]+，1H-NMR( CD3OD,400MHz) 谱显示分子中存在1个邻位取代苯的结构δ4.52 (dd,1H,J=5.6,3.2Hz,H-7)，4.59(dd,1H,J=5.6,3.2Hz,H-6)，1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：4.12 (d,1H,J=1.9Hz,H-4')，4.52 (d,1H，J=8.0Hz，H-7)，4.59(d,1H,H-6)，6.85(d,2H,J=8.3Hz,H-3',5')，6.97(s,1H,H-8),7.46(s,1H,H-5)，7.49(d,2H,H-2',6')，8.41(s,1H,H-1)。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：103.3(C-8)，108.1(C-5)，115.4(C-5')，118.1(C-3')，119.2(C-4)，124.1(C-2'，6')，126.1(C-1')，130.8(C-2)，146.2(C-6) ，151.1(C-9)，153.2(C-7)，154.3(C-1)，175.3(C-3,C=O)。以上理化性质和光谱数据与文献[7]报道的基本一致，鉴定化合物2 为6,7-二羟基-3-(4'-羟基)异黄酮。

化合物3：白色粉末状，分子式为C7H6O2，mp 111～112℃。薄层色谱以5%FeCl3溶液显色，呈现蓝黑色，显示有酚羟基存在。IR(KBr)光谱显示有羟基在3 519cm-1处有最大吸收 ，在1 684cm-1处有羰基吸收峰。苯环吸收：1 645、1 591、1 519、1 441cm-1。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz)谱芳香区中信号中在低场区给出2组芳氢质子信号：δ7.65 (d,2H，J=8.0Hz,H-2,6)，6.89 (d,2H，J=8.0Hz,H-3,5 )，提示分子中存在一个典型的1,4-二取代苯环，在低场区出现一个醛基信号δ9.82(s,1H,CHO)。EI-MS：m/z 120.9[M]+。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ：9.82(s,1H,CHO)，7.65 (d,2H，J=8.0Hz,H-2,6)，6.89 (d,2H，J=8.0Hz,H-3,5 ),8.92(s,1H,-OH)。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：116.7 (C-3,5)，129.2 (C-1)，132.1 (C-2,6 )，164.1(C-4 ),192.5(-CHO )。以上理化性质和光谱数据与文献[8]报道的基本一致，鉴定化合物3为对羟基苯甲醛。

化合物4：无色针状粉末，分子式为C7H6O3，mp 158～159℃。薄层色谱以5%FeCl3溶液显色，呈现蓝黑色，显示有酚羟基存在。IR (KBr)光谱显示有羟基在3 642cm-1处有最大吸收。1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ11.19(s,1H,-COOH)显示有活泼氢。1H-NMR(CD3OD，400 MHz) 谱芳香区中信号中在低场区有4组芳香氢质子信号：δ7.79 (dd,1H，J=8.0Hz,H-6)，7.51(d,1H，J=7.9,7.5Hz,H-4)，7.01(d,1H，J=8.0Hz,H-3)，6.89(d,1H,J=7.9,7.2Hz,H-5)，提示分子中存在苯环的 1,2-二取代。EI-MS：m/z 137.1[M]+。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：113.5(C-1)，118.2 (C-3)，132.1 (C-6 )，135.9(C-4 )，162.5(C-2)，173.1(-COOH)。以上理化性质和光谱数据与文献[9]报道的基本一致，鉴定化合物4为邻羟基苯甲酸(又名水杨酸)。

化合物5：淡黄色粉末，紫外吸收光谱中在波长217、271nm处呈现最大吸收，提示有甲氧基的存在。通过高分辨质谱和质谱测定得到该化合物的相对分子质量为282。1H-NMR谱在低场区给出2组芳香氢质子信号：(CD3OD,360MHz)δ:6.76(d,2H,J=3.0Hz,H-3',5')，7.15(d,2H,J=8.0Hz,H-2',6')，提示分子中存在1个1,4-二取代苯环，δ55.4为甲氧基的信号，氢谱3.79(3H,s)的信号佐证了这一推测。该化合物的HBMC谱(图1)显示：5-H(6.96，s)与4-C,9-C相关，8-H(6.31,s)与4-C,6-C,7-C相关，6'-H(7.15,d)与1'-C,2'-C相关，5'-H(6.76，d)与1'-C,3'-C相关，2'-H(7.15,d)与1-C,1'-C,3'-C相关，3'-H(6.76,d)与2'-C,5'-C相关，甲氧基上的氢与4'-C相关。鉴于HBMC谱显示的相关关系，进一步参照1H-1H COSY和HMQC谱，证实化合物5的结构，结构式如图2。

图1 化合物5的HBMC谱 图2 化合物5的结构式

化合物5的分子式为C16H12O5，mp 257～259℃。盐酸-镁粉反应呈阳性，显示为黄酮类化合物。IR (KBr)光谱显示，在3121cm-1有羟基的吸收峰，1 749cm-1处明显C=O吸收。苯环吸收：1 615,1 583,1 521,1 428,1 180,1120,1 011,831cm-1。EI-MS：m/z 284.1[M]+。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:3.79(s,3H,-OCH3)，6.31(s,1H,H-8)，6.76(d,2H,H-3',5')，6.96(s,1H,H-5)，7.15(d,2H,H-2',6')，14.53(s,1H,-OH) 。13C-NMR(CD3OD,100MHz)δ：55.4(C-OCH3)，105.8(C-8)，115.1(C-3',5')，116.9(C-5)，127.6(C-2'，6')，137.1(C-2)，152.1(C-9)，159.6(C-1)，177.3(C-3,C=O)，180.3(C-6)，191.2(C-7)。由以上理化性质和光谱数据，鉴定为未见报道过的新化合物5：7,8-环氧基-2-(4'-甲氧基苯基)黄酮醇，命名为黄酮YN。

3 讨论

齿瓣石豆兰全草具有较高的药用价值，该属植物是常用中草药，全草可入药。本研究对齿瓣石豆兰的黄酮类成分进行了分离提取及鉴定，经硅胶柱层析、薄层层析、Sephadex LH-20柱层析和重结晶等方法分离纯化，根据化合物的理化性质和光谱数据鉴定其化学结构，从齿瓣石豆兰的提取物氯仿、甲醇萃取部分共分离到5个单体化合物，分别为6-甲氧基-2-(4'-甲氧基苯基)-3-羟基-色原酮(1)、6,7-二羟基-3-(4'-羟基)异黄酮(2)、对羟基苯甲醛(3)、水杨酸(4)、黄酮YN(5)，所有化合物均为首次从齿瓣石豆兰全草中分离得到。本研究结果对进一步探索齿瓣石豆兰的药理活性物质基础具有一定的参考价值。