龙胆草总酚含量测定和自由基清除活性研究

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(1.广西中医药大学 药学院，广西 南宁530001；2.南宁师范大学 化学与材料科学学院，广西 南宁 530001)

研究表明，帕金森症等众多疾病与人体内自由基失衡有关，因此，寻找具有良好自由基清除能力的天然抗氧化剂成为研究的热点之一[1，2]。龙胆草(Gentianarigescens)是龙胆科龙胆属植物，多年生草本，高30～60cm；根茎平卧或直立，短缩或长达5cm，具粗壮、略肉质的须根；花枝单生，直立，黄绿色或紫红色，中空，近圆形，具条棱，棱上具乳突，稀光滑。龙胆草具有清热燥湿、泻肝定惊的功效，可用于治疗湿热黄疸、小便淋痛、阴肿阴痒、湿热带下、肝胆实火之头胀头痛、目赤肿痛、耳聋耳肿、胁痛口苦、热病惊风抽搐等病证[3]。目前，对于龙胆草的抗氧化能力未见报道。本研究采用不同溶剂对龙胆草进行提取，得到龙胆草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，并测定其提取物的总酚含量和自由基清除能力。

1 材料与仪器

UV1901型紫外可见分光光度计(北京普析电子科技有限公司)；地肤子从广西玉林药材市场购买；没食子酸标准品从百灵威试剂公司(北京)购买。

2 方法

2.1 龙胆草不同溶剂提取物的制备

将龙胆草剪碎后打成粉末，取20 g龙胆草粉末放入圆底烧瓶，分别加入200 mL乙醇、丙酮及乙酸乙酯。冷浸72 h后将提取液倒出，加入新的溶剂，重复浸泡3次。将提取液合并后用旋转蒸发仪将溶剂回收，得到龙胆草的乙醇、丙酮及乙酸乙酯提取物。

2.2 ABTS·+自由基清除能力测定[4]

将50 mL的2 mM的2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)溶液与200 mL K2S2O8水溶液(70 mM)混合，摇匀后避光12～16 h得到ABTS·+溶液，并用磷酸盐缓冲液将其稀释至73 nm处，吸光度为(0.70±0.02)。取一定量提取物溶液，加入1.9 mLABTS·+溶液，在不同时间点测其吸光度并计算提取物对ABTS·+自由基清除率。

2.3 总酚含量测定

2.3.1 Folin-Ciocalteu试剂的配制 在圆底烧瓶中装入80 g钨酸钠和20 g钼酸钠，加入 560 mL蒸馏水，溶解后加入40 mL磷酸溶液(85%)和80 mL浓盐酸，回流10 h后加入12 g硫酸锂及60 mL双氧水，加热沸腾15min至溶液呈亮黄色，冷却后定容至1 000 mL。

2.3.2 提取液中总酚含量的测定 将龙胆草提取物溶液分别加入1 mL Folin-Ciocalteau试剂，混合均匀。加入3 mL 2 % Na2CO3溶液后用蒸馏水定容到10 mL，2 h后测量溶液在760 nm处的吸光度。提取液中总酚含量根据回归方程计算。

3 结果

3.1 不同浓度提取物对ABTS·+自由基清除能力的影响

龙胆草乙醇提取物对ABTS·+自由基的清除能力如图1所示。可见，随着提取物浓度增加，乙醇提取物对ABTS·+自由基的清除能力增强。在作用时间为5 min时，浓度为0.5 mg/mL的乙醇提取物对ABTS·+自由基的清除率为17.7 %，当浓度增加到1.0 mg/mL时清除率增大到25.5 %。同时，EE对ABTS·+自由基的清除能力与作用时间有关。对于浓度为1.8 mg/mL的乙醇提取物，1 min时对ABTS·+自由基的清除率为38.6 %，当作用时间增加到10 min，其对ABTS·+自由基的清除率增加到58.8 %。

图2显示不同浓度龙胆草丙酮提取物对ABTS·+自由基的清除能力。丙酮提取物的ABTS·+自由基清除效果随不同提取物浓度和作用时间的变化规律与乙醇提取物相似。随着提取物浓度和作用时间增加，丙酮提取物对ABTS·+自由基的清除能力增加。作用时间为5 min时，提取物浓度为0.5和0.8 mg/mL的丙酮提取物对自由基清除率分别为15.9 %和26.2 %，浓度为1.5 mg/mL和1.8 mg/mL时清除率分别为39.4 %和46.9 %，当浓度增加为2.0 mg/mL时清除率达到71.1 %。对于浓度为1.8 mg/mL的丙酮提取物，其对ABTS·+自由基的清除能力从1 min时的52.4 %迅速增加到10 min时的66.7 %。

3.2 不同溶剂提取物对ABTS·+自由基清除率的比较

龙胆草不同溶剂提取物在10 min时对ABTS·+自由基清除能力如图3所示。在最低浓度0.5 mg/mL时，丙酮提取物的清除率为17.0 %，乙醇提取物和乙酸乙酯提取物的清除率分别为20.2 %和22.8 %。在1.0 mg/mL时，乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物对ABTS·+自由基清除率分别为31.9 %、35.8 %和32.5 %。在最高浓度2.0 mg/mL时，丙酮提取物表现出最强的清除能力，其对ABTS·+自由基清除率为77.0 %。

3.3 不同溶剂提取物总酚含量测定结果

龙胆草乙醇提取物、乙酸乙酯提取物和丙酮提取物的总酚含量分别为31.3 mg/g、21.9 mg/g和30.2 mg/g。三种提取物都具有较高的总酚含量，其优良的自由基清除效果可能与其含有的酚类成分有关。

图1 龙胆草乙醇提取物对ABTS·+自由基的清除能力

图2 龙胆草丙酮提取物对ABTS·+自由基的清除能力

图3 龙胆草溶剂提取物对ABTS·+自由基的清除能力

提取物EC50(mg/mL) 乙醇提取物1.41乙酸乙酯提取物1.70丙酮提取物1.53

4 结论

在本研究中，我们用不同溶剂对龙胆草进行提取，得到龙胆草的乙醇、丙酮和乙酸乙酯提取物，通过测定其提取物的总酚含量和自由基清除能力。结果表明，龙胆草三种溶剂提取物都表现出良好的自由基清除能力，其对ABTS·+自由基的EC50值在1.41～1.70 mg/mL范围内，表明三种溶剂提取物对这类自由基均表现出良好的清除效果。随着浓度和时间的增加，提取物对ABTS·+自由基的清除能力增强，表明三种提取物优良的自由基清除效果可能与其含有的酚类成分有关。