HPLC法同时测定补肾温肺合剂中6种活性成分含量

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(湖南中医药高等专科学校，湖南 株洲 412012)

补肾温肺合剂是湖南省直中医院(我校附属第一医院)的院内制剂，由淫羊藿、五味子、山茱萸、防风、白术等十味中药组成，具有补肾温肺、固表化饮之功效，临床上用于过敏性鼻炎、哮喘、慢性支气管炎等疾病的治疗。目前该制剂在质量控制上仅为薄层色谱法的定性鉴别和淫羊藿中淫羊藿苷的含量测定，制剂中其他主要有效成分含量测定的方法尚未见报道。为了更有效地控制该制剂的质量，本文建立了一种同时测定莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲6种主要活性成分含量的方法，为补肾温肺合剂的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20A高效液相色谱仪，包括SPD-M20A二极管阵列检测器、LC-20AT泵、SIL-20A自动进样器、岛津LC-solution色谱数据工作站；KQ5200DA超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂

对照品莫诺苷(批号25406-64-8)、马钱苷(批号18524-94-2)、升麻素苷(批号80681-45-4)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号84272-85-5)、淫羊藿苷(批号489-32-7)、五味子醇甲(批号7432-28-2)，所有对照品纯度均大于98%，均购自贵州迪大生物科技有限责任公司。补肾温肺合剂(100 mL/瓶，批准文号：湘药制字Z20070353，批号171010、171206、180320)。甲醇为色谱醇，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的对照品适量，加甲醇溶解并定容于20 mL量瓶中，摇匀，制成含莫诺苷0.33 mg·mL-1、马钱苷0.26 mg·mL-1、升麻素苷0.39mg·mL-1、5-O-甲基维斯阿米醇苷0.29 mg·mL-1、淫羊藿苷0.25 mg·mL-1、五味子醇甲0.25 mg·mL-1的混合溶液，即得。

2.1.2 供试品溶液 精密量取补肾温肺合剂1 mL，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，超声处理5 min，加50%甲醇至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，置于阴凉处保存。

2.1.3 阴性样品溶液 按处方分别制备缺少淫羊藿、五味子、山茱萸、防风的阴性样品，按照“2.1.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

Phenomenex luna C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，线性梯度洗脱(0～20 min，45%A；20～21 min，45%A→65%A；21～30 min，65%A；30～35min，65%A→67%A)，流速1.0 mL·min-1，检测波长240 nm(莫诺苷和马钱苷)、250 nm(五味子醇甲)、254 nm(升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷)和270 nm(淫羊藿苷)，柱温30 ℃，进样量10 μL。在上述色谱条件下，混合对照品、样品及阴性样品色谱图见图1。

2.3 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分别置于5mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度的混合对照品溶液。取上述不同浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标，质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，得莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的回归方程，见表1。

1.莫诺苷(morroniside)；2.马钱苷(loganin)；3.升麻素苷(Prim-o-glucosylcimifugin)；4.5-O-甲基维斯阿米醇苷(5-O-methylvisammioside)；5.五味子醇甲(icariin)；6.淫羊藿苷(schisandrin)

图1混合对照品(A)、样品(B)、不含山茱萸的阴性样品(C)、不含防风的阴性样品(D)和不含淫羊藿的阴性样品(E)和不含五味子的阴性样品(F)色谱(254nm)

2.4 精密度试验

取上述6种组分的混合对照品溶液，连续进样6次，按照“2.2”项下色谱条件测定，结果莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的RSD分别为1.2%、1.1%、0.96%、1.3%、0.92%、1.5%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24h进样测定，结果莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲峰面积的RSD分别为1.1%、0.95%、1.2%、1.5%、0.97%、1.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

表1 6个成分的线性回归方程

2.6 重复性试验

按照“2.1.2”项下条件平行制备供试品溶液6份，根据“2.2”项下条件进样测定。结果莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲含量平均值(n=6)分别为2.29、1.13、2.85、0.46、0.32、0.18 mg·mL-1，RSD分别为1.3%、0.95%、0.98%、1.1%、0.99%、1.2%。表明方法重复性良好。

2.7 加样回收率

精密量取“2.6”项下已测知6种成分准确含量的补肾温肺合剂样品0.6 mL，共9份，再分别精密加入相当于含量120%、100%、80%的莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲对照品溶液，分别制备得到高、中、低不同浓度的供试溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

2.8 样品含量测定

取3个批次的补肾温肺合剂，按照“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件测定6种成分含量。结果见表3。

表2 加样回收率试验结果 (n=3)

表3 补肾温肺合剂中6种成分含量 (mg·mL-1，n=3)

3 讨论

3.1 质量评价指标的选择

补肾温肺合剂中淫羊藿为君药，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。淫羊藿中的单体化合物以淫羊藿苷含量最高，现代药理学研究表明，淫羊藿苷具有抗炎、抗氧化应激、促进神经突触生长等活性[1]。《中国药典》(2015版)将淫羊藿苷作为淫羊藿质量控制的指标性成分[2]。五味子也为补肾温肺合剂中的君药，具有益气生津、补肾宁心之功效。五味子醇甲是五味子的主要活性成分，具有抑制脑内神经递质分泌、保护受损神经细胞等作用[3]。《中国药典》(2015版)将五味子醇甲作为五味子质量控制的指标性成分[2]。山茱萸和防风均为补肾温肺合剂中的臣药。其中，山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱之功效，莫诺苷和马钱苷作为山茱萸的主要活性成分，具有抗氧化应激损伤、抗炎、抗血栓等药理作用[4]。2015版《中国药典》将二者作为山茱萸质量控制的指标性成分[2]。防风具有祛风解表、胜湿止痛之功效，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷是防风中含量较高的活性成分，具有止痛、抗炎、解热等药理作用[5]。2015版《中国药典》将二者作为防风质量控制的指标性成分[2]。因此，本文选择莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲作为补肾温肺合剂的质量评价指标。

3.2 流动相的选择

根据相关文献[6-9]，本实验首先考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水等不同溶剂系统，结果显示甲醇-0.1%甲酸水溶液作为洗脱剂可以实现几种成分的较好分离，且峰形良好。其次，考察了不同的酸(甲酸、磷酸)对分析结果的影响，结果显示2种酸对分析结果并无明显影响。在考察酸体积分数(0.02%，0.05%，0.1%，0.2%)时，当甲酸体积分数达到0.1%或0.2%时，色谱峰的峰形良好，但是当甲酸体积分数低于0.1%以下时，5-O-甲基维斯阿米醇苷的峰宽变大。因此，最后流动相条件确定为甲醇-0.1%甲酸水溶液。

3.3 检测波长的选择

紫外扫描显示，莫诺苷、马钱苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、淫羊藿苷和五味子醇甲的最大吸收波长分别为240 nm、236 nm、254 nm、254 nm、270 nm和251 nm，参照相关文献[10-13]及《中国药典》(2015版)一部“山茱萸”“防风”“淫羊藿”“五味子”项下指标成分含量测定波长，确定莫诺苷和马钱苷的检测波长为240 nm，升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的检测波长为254 nm，淫羊藿苷检测波长为270 nm，五味子醇甲的检测波长为250 nm。