复方肿节风清咽合剂质量标准研究

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(贵阳中医学院第二附属医院 药学部,贵州 贵阳 550003)

复方肿节风清咽合剂为贵阳中医学院第二附属医院院内制剂，该制剂为耳鼻喉科临床医生在长期临床实践的基础上，通过自主研发而成的中药成方院内制剂，经过多年临床观察，疗效确切，患者反映良好，并于2014年获得医院制剂批文( 批准文号: 黔药制字Z20140036) 。复方肿节风清咽合剂由肿节风、麦冬、鱼腥草、桔梗和红花五味中药组成，具有清热解毒、消肿止痛、清利咽喉等功效，主要用于伴有咽喉肿痛、咽痒、咳嗽症状的扁桃腺炎，喉痹(急、慢性咽炎)，尤其对急性咽炎有良好的治疗效果[1]。这个制剂后来在原有汤剂的工艺上进行了剂型改进，成为合剂[2]，具有使用方便、起雾效果好等特点，经口腔黏膜超声后，既起到局部理疗的作用，又使药液直达患处，具有抗炎、消肿止痛、清热解毒、润喉利咽之功效。本实验采用薄层色谱法对处方中肿节风、桔梗、红花进行定性鉴别；采用高效液相色谱法测定制剂中反丁烯二酸的含量，并对测定的方法学进行了考察，结果证实检测方法准确可靠，可用于复方肿节风清咽合剂的质量控制。现将实验过程报道如下。

1 材料与仪器

1.1 材料

实验试剂包括乙酸乙酯、甲醇、环己烷、甲酸、正丁醇、丙酮、三氯甲烷、乙腈(色谱纯)、磷酸、双重蒸馏水等；反丁烯二酸对照品(含量99.4%，批号：111541-201102，由中国食品药品检定研究院提供，用于含量测定)；硅胶G板、硅胶H板(青岛海洋化工厂)；聚酰胺薄膜板(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂出品)。实验样品由本院自制。

1.2 仪器

①Agilant 1260高效液相色谱仪(包括G1311C四元泵，G1329B自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B 二极管阵列检测器，G1329B自动进样器，G4212B DAD检测器， G1311C四元泵，G1316A 1260柱温箱，LC-1260色谱工作站)；②SK5210HP型超声波清洗器；③ESJ182-4电子天平(十万分之一)；④98-1-B型电子调温电热套；⑤101-2AB电热鼓风干燥箱；⑥ZF-20D暗箱式紫外分析仪；⑦DZKW-4型电子恒温水浴锅。

2 方法及结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 肿节风鉴别 取本样品15 mL，加入15 mL水稀释，用60 mL乙酸乙酯分两次萃取，合并乙酸乙酯萃取液，水浴蒸干，加1 mL甲醇溶解残渣，作为供试品溶液。取缺肿节风的阴性制剂15 mL，同法制备阴性对照液。另取肿节风对照药材2.0 g，滤液同供试品制备法制备对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照药材溶液5 μL，其余两种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶5∶1)的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热5 min，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[3]。见图1。

2.1.2 麦冬鉴别 取本品20 mL，加10 mL水稀释，加入0.3 g硅藻土混匀，离心15 min，取上清液加盐酸0.9 mL，小火微沸8 min，冷却，用20 mL三氯甲烷分2次萃取，合并三氯甲烷液，水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为供试品溶液。取缺麦冬的阴性制剂20 mL，同法制备阴性对照液。另取麦冬对照药材2.0 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干，加水20 mL使溶解，按照以上“加盐酸”同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照药材溶液5μL，其余两种溶液各10～15 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿-丙酮(8∶2)的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，分别显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[3]。见图2。

2.1.3 红花鉴别 取本品20 mL，加30 mL水稀释，置分液漏斗中，用50 mL正丁醇萃取，分取正丁醇层，水浴蒸干，残渣加水50 mL使溶解，用50 mL乙酸乙酯振摇提取，弃去乙酸乙酯层；水层用50 mL正丁醇振摇萃取，取正丁醇液，水浴蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。取缺红花的阴性制剂20 mL，同法制备阴性对照液。另取红花对照药材1.0 g，加80 %丙酮溶液50 mL，超声3 0min，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取对照药材溶液3 μL，其余两种溶液各5 μL点于同一聚酰胺薄膜板上，以乙酸乙酯-甲酸-水-甲醇(10∶2∶1∶0.2)的溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1 %三氯化铝乙醇液，热风吹至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰[3]。见图3。

2.2 反丁烯二酸含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱为DIKMA Diamonsil®C18(5 μm,4.6 mm×250 mm),流动相为乙腈-0.1 %磷酸溶液(2∶98)，二极管阵列波长扫描范围：190～360 nm，柱温：30 ℃，流速：1.0 mL/min，进样量：10 μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取反丁烯二酸对照品9.49 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，得对照品贮备液于5℃冰箱保存备用，精密吸取2 mL置于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。(每1mL含反丁烯二酸30.368 μg)。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取复方肿节风清咽合剂样品5 mL，置100 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 系统适用性试验 分别取对照品溶液、供试品溶液和缺肿节风药材的阴性空白溶液进样，见图4。反丁烯二酸的保留时间为6.5 min，阴性空白色谱图在反丁烯西二酸峰位置处无干扰峰，反丁烯二酸与其他组分分离完全(分离度>1.5)。理论板数以反丁烯二酸峰计算应不低于6 000。

2.2.5 方法学考察 线性关系考察:精密量取反丁烯二酸对照品贮备液2 mL置50 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成15.184 μg/mL的对照品溶液，分别精密吸取该对照品溶液1、5、9、13、17、21、25 μL，注入液相色谱仪，以反丁烯二酸进样量(μg)为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归计算，线性回归方程为：Y=8 310.4X+11.999，R2=0.999 8，反丁烯二酸在0.0151 84～0.379 6 μg范围内线性关系良好。线性回归曲线见图5。

图1 制剂中肿节风薄层鉴别 图2 制剂中麦冬薄层鉴别 图3 制剂中红花薄层鉴别

图4 复方肿节风清咽合剂的HPLC色谱

图5 反丁烯二酸对照线性回归曲线

精密度试验：精密吸取对照品溶液(15.184μg/mL)10μL按上述色谱条件，重复进样，结果反丁烯二酸的平均峰面积为1284.7835(n=6)；RSD为0.98%。

重复性试验：取样品(批号：20160601)，按“2.2.3”项下制备供试品溶液(n=6)，进样10μL，测定峰面积，供试品中反丁烯二酸的平均含量为0.27mg/mL，RSD为0.83%，表明该方法的重复性良好。

稳定性试验：取重复性试验中的第一份供试液，考察0、2、4、6、10、12h测定反丁烯二酸峰面积，结果反丁烯二酸平均含量为0.26mg/mL，RSD为1.4%，说明在12h内供试液稳定性良好。

回收率试验：精密吸取已知反丁烯二酸含量的复方肿节风清咽合剂样品(批号：20160601 反丁烯二酸含量0.271 42mg/mL)2mL，置100mL量瓶中，加入反丁烯二酸对照品溶液(0.303 5mg/mL)2mL，按供试品溶液的制备方法制备，进样10μL，测定，计算回收率。回收率实验结果见表1。

表1 复方肿节风清咽合剂中反丁烯二酸回收率试验结果

2.2.6 样品测定 按上述供试品溶液制备，并按上述色谱条件测定8批复方肿节风清咽合剂中反丁烯二酸的含量，按外标法计算峰面积。测定结果见表2。

3 结语

通过本实验研究，经过多种提取方法和展开系统的考察，最终确定对该制剂的质量控制除肿节风、红花、麦冬可以定性鉴别外，在对应的色谱中相应的位置上，其余药材均有阴性干扰，因此未能列入质量标准草案中[4，5]；在反丁烯二酸定量方法建立时，分别采用了不同溶剂及不同时间下以直接稀释法或超声法制备供试品溶液，以水作为溶剂直接稀释法制备样品时反丁烯二酸含量较高且方法简便；同时还分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液的不同比例色谱条件，结果以乙腈-0.1%磷酸溶液(2∶98)时分离度及峰型均较好，并通过回收率实验验证了本方法准确可靠。反丁烯二酸的平均含量为0.2775mg/mL ，从大批量规模生产考虑，本品每毫升含反丁烯二酸的量，其限度以80%计算，换算成每瓶含(100mL/瓶)反丁烯二酸(C4H4O4)计，不得少于22mg。通过HPLC-DAD方法学的考察，证实该方法简便易操作，准确度较高，可作为复方肿节风清咽合剂的质量控制标准。

表2 八批样品含量测定结果 (n=2)