黏附G蛋白偶联受体激活和信号转导机制及其在巨噬细胞中作用的研究进展

项前，金培培，卢文斌，林省委，孟庆元，郭品豪，卞金俊

(海军军医大学长海医院，上海200433)

黏附G蛋白偶联受体(aGPCRs)属于G蛋白偶联受体(GPCRs)家族成员之一。在迄今发现的800多个不同的GPCRs中，aGPCRs的结构最复杂，其包括不同功能蛋白域的嵌合组成，整合了细胞外细胞黏附功能与细胞内GPCRs信号传导功能[1]。aGPCRs分布广泛，在免疫应答、肿瘤发生和许多发育过程中都起着重要作用[1～3]。巨噬细胞是一类重要的免疫细胞，既可作为抗原提呈细胞，又能释放各种活性物质间接或直接地参与各种炎症反应，其激活后产生的大量炎性因子可引起炎症反应失控，导致免疫功能紊乱[4]。部分aGPCRs表达于巨噬细胞表面，并对巨噬细胞的免疫功能具有一定的调节作用[5]，其中ADGRB1和ADREGE类成员与巨噬细胞的吞噬、白细胞活化和迁移等过程紧密相关[1]。然而，由于缺乏内源性配体、产生的抗体活性未知和信号传导途径未识别等原因，对aGPCRs的研究受到阻碍。本文结合aGPCRs的分子结构、激活和信号转导机制，将aGPCRs在巨噬细胞中的作用研究进展综述如下。

1 aGPCRs的分子结构和激活、信号转导机制

1.1 aGPCRs的分子结构 aGPCRs可分为细胞外结构域(ECD)、7TM结构域和细胞内结构域(ICD)[6]。aGPCRs与其他GPCRs家族成员不同，其通常存在300～6 000个残基的异常大的ECD[5]。在ECD的N-末端半部，通常存在多种串联的特征蛋白基序(即黏附蛋白基序)，如表皮生长因子(EGF)、免疫球蛋白(Ig)、正五聚蛋白(PTX)、血小板反应蛋白(TSP)、富含亮氨酸的重复序列(LRR)和凝集素样结构域，可促进细胞之间和基质之间相互作用[5]。此外，这些结构域在单个aGPCR中的组合复杂性形成了受体家族结构和功能的高度多样性。紧随黏附蛋白基序的是一种新的自蛋白水解诱导(GAIN)结构域，在大多数aGPCRs中它启动独特的翻译后蛋白水解修饰[7]。GAIN由subdomain A和subdomain B组成。GPS水解位点是subdomain B的一部分。GAIN结构域介导的蛋白水解被认为是在aGPCRs生物合成过程中在内质网腔中发生，并且是通过在GPS保守的HL/T(S)序列上的一系列亲核反应自催化实现的[8]。

aGPCRs在GPS位点自发水解为N-端片段(NTF)和C-端片段(CTF)两部分。研究发现，GPR56的整个ECD的更新结构表征显示GAIN结构域包含一个只有三个螺旋的小subdomain A，但是高度保守的subdomain B，表明GAIN结构域比原本认为的要更加多变[9]。此外值得注意的是，并非所有的aGPCRs都在GAIN区域可裂解，因为在它们的GPS内缺乏一致的催化三元序列，这是自蛋白水解的先决条件[7]。目前关于GAIN结构域自水解对受体功能的影响尚无明确结论。

1.2 aGPCRs的激活和信号转导机制 静息状态下aGPCRs几乎不提供任何信号。配体结合NTF或机械力都可以激活受体，导致G蛋白依赖性或非依赖性的信号传导。被称为Stachel的副膜系激动剂序列与CTF的结合证明在这些过程中起关键作用。aGPCRs也可以通过与同一细胞上的其他受体相互作用来介导信号转导。

1.2.1 激活机制 有研究将aGPCRs归入由整体激动剂激活的GPCRs组中[15]，而且发现来自GPS的C-端保守序列的肽能够激活7TM[10]。基于以上研究可推测，ECD内部结构发生变化时，这种分子内激动剂暴露于7TM结构域或在7TM结合口袋内异构化，进一步启动G蛋白激活[11]，这是aGPCRs的一个常见激活机制。见图1。

研究显示，细胞外配体的结合可诱导aGPCRs介导的细胞内信号转导。例如，Ⅳ型胶原和细胞朊病毒蛋白C可以在结合GPR126的N-端时诱导生成环磷酸腺苷(cAMP)[12]，进而激活蛋白激酶A(PKA)，调节靶细胞蛋白磷酸化。另有研究显示，细胞振动可导致受体介导的cAMP形成[12]。提示aGPCRs可能作为代谢性机械传感器[13]，在机械力驱动下发生激活。由此推测，自蛋白裂解的N-端的去除以及结合到细胞外基质或邻近细胞的N-端与aGPCRs表达细胞之间的相对运动均可导致受体激活。

上述研究表明，aGPCRs具有经典GPCRs的许多特征，包括多重G蛋白偶联能力、G蛋白独立信号转导和副膜系激动作用，同时也具有信号整合、机械敏感性和通过其大ECD进行信号转导等新特性。

1.2.2 信号转导机制 已知aGPCRs能够激活G蛋白依赖和非依赖信号通路。G蛋白依赖性信号转导主要代表为黏附G蛋白偶联受体B1(ADGRB1)。BAI1通过7TM结构域的胞质尾部与ELMO、DOCK1和Rac形成三聚体复合物，介导巨噬细胞对凋亡细胞和革兰氏阴性细菌的吞噬作用[14]。G蛋白非依赖性信号传导也已为黏附家族其他成员证实。研究发现，CELSR1与Frizzled/Disheveled、DAAM1和PDZ-RhoGEF的直接串扰可导致肌动蛋白依赖性的平面极化收缩[15]。另外对GPR124[16]和GPR125[17]的研究显示，Wnt/β-catenin通路和Wnt/平面细胞极性通路均参与了aGPCRs信号传导。

近年来，aGPCR的去孤子化鉴定出许多单个aGPCR的内源性和外源性结合配体[1]。这些配体中的大多数是细胞膜蛋白或细胞外基质蛋白质类，此外多糖、脂肪酸和磷脂糖脂配体(如糖胺聚糖、PtdSer、LPS)也能结合特定aGPCRs[1,18]。虽然有限数量的配体能够诱导aGPCRs信号，但迄今发现的大多数配体似乎不能激活其同源aGPCRs。这个结果提示许多配体可能仅仅作为aGPCRs的结合配体，而没有任何功能输入。由于最近aGPCRs激活的所谓副膜系激动机制的揭示，新近的研究使得后者的解释更加有说服力[10]。

2 aGPCRs在巨噬细胞中的作用

aGPCRs广泛分布于大多数细胞类型和器官系统中，包括造血系统的细胞，而表达于巨噬细胞的主要有ADGRB1、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE5、GPR116等[19]。这些aGPCRs通过不同的方面，对巨噬细胞的功能产生一定的调节作用。

2.1 ADGRB1 ADGRB1最初被鉴定为抗血管生成和抗肿瘤分子[20]，负责抑制血管生成的功能片段是其NTF的一部分。尽管其在大脑丰富表达[21]，但是ADGRB1蛋白不局限于中枢神经系统，也可见于单核细胞、巨噬细胞和胃上皮细胞[1]。ADGRB1的ECD由五个串联排列的血小板反应蛋白重复序列(TSR)、一个HRM和一个RGD基序组成。每个TSR区域都具有不同的表面电荷分布，这导致不同的蛋白质之间的偏向作用[1]，这个TSR区域在ADGRB1蛋白的免疫功能中起着关键作用。

ADGRB1是一种多功能分子，与许多内源和外源配体结合。ADGRB1可以结合临终细胞表面的PtdSer，在巨噬细胞中作为凋亡细胞的吞噬受体[22]。研究显示，斑马鱼胚胎脑中的巨噬细胞/小胶质细胞利用ADGRB1控制垂死神经元周围吞噬体的形成和转运[22]。ADGRB1介导的巨噬细胞清除凋亡细胞显示出通过随后产生抗炎介质和调节脂质稳态来促进抗炎反应，其中部分通过上调ATP结合盒式转运体1(ABCA1)来实现[23]。类似地，ADGRB1介导的对结肠上皮凋亡细胞去除减轻了小鼠实验性结肠炎中过度凋亡细胞引起的炎症加重[14]。除了内源性配体，ADGRB1还通过与LPS结合作为模式识别受体，介导巨噬细胞对革兰阴性菌的吞噬作用。研究证明，ADGRB1通过Rac1激活的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶促进活性氧的产生，从而增强体内巨噬细胞的杀菌活性[24]。

2.2 ADGRE1 鼠ADGRE1(F4/80)在巨噬细胞、CD8+髓样树突状细胞、朗格汉斯细胞和嗜酸性粒细胞上均有表达[1]，是一种广泛应用于小鼠组织巨噬细胞的表面标记物[25]。最近，抗F4/80(mAb)及其衍生物被应用于示踪体内组织特异性巨噬细胞并通过细胞靶向性抗细胞因子来治疗巨噬细胞介导的自身免疫疾病[26]。然而在F4/80缺陷动物的巨噬细胞中并未发现明显的表型改变，表明F4/80分子对于小白鼠的正常发育和成熟并非必需[27]。

2.3 ADGRE2 ADGRE2在单核细胞和巨噬细胞上高度表达[1]。研究发现，类风湿关节炎患者滑膜组织中ADGRE2表达高于对照组。在炎症组织中，ADGRE2在巨噬细胞和中性粒细胞中的表达都有所增加。通过固定化2A1单抗激活ADGRE2可诱导巨噬细胞产生促炎细胞因子，如白细胞介素8和肿瘤坏死因子[28]。这也可能成为类风湿关节炎治疗的潜在研究途径。

2.4 ADGRE5 ADGRE5在几乎所有类型的髓样细胞中均有表达，并且在某些自身免疫性疾病的巨噬细胞亚群中表达进一步上调，如类风湿关节炎滑膜中浸润的巨噬细胞、高雪症脾巨噬细胞和多发性硬化性脑病中的脑泡沫巨噬细胞[1]。有研究证明，给予小鼠ADGRE5中和单克隆抗体可改善小鼠胶原诱导的关节炎，而且ADGRE5敲除的动物在两种不同的类风湿关节炎动物模型中均显示出疾病活动度降低[29]。这些都为ADGRE5在自身免疫病的治疗中提供了可能的研究思路。

2.5 GPR116 GPR116也称Ig-Hetpa，包含在其NTF中的有精子蛋白、肠激酶、agrin(SEA)结构域和两个Ig样结构域[59]。SEA结构域是一个保守的独立蛋白折叠结构，能够进行自蛋白水解裂解，类似于GAIN结构域[30]。因此，GPR116在生物合成过程中经历两种不同的自蛋白水解修饰事件，产生多个蛋白片段。最近对GPR116基因敲除小鼠的分析表明，GPR116在肺泡巨噬细胞的功能调节中发挥作用。GPR116缺陷小鼠的肺泡巨噬细胞显示泡沫状和被活化，导致肺局部炎症和肺气肿样症状，推测可能是由于ROS和基质金属蛋白酶的生成增加所致[31]。

2.6 GPR97 虽然对GPR97在人单核巨噬细胞中的作用知之甚少，但在GPR97基因敲除小鼠中报道了小鼠GPR97在调节巨噬细胞炎症中的潜在作用[32]。在高脂饮食诱导的小鼠肥胖模型中，GPR97缺乏导致肝脏和肾脏中浸润的巨噬细胞数量增加，肿瘤坏死因子水平升高，以及白色脂肪组织中M1型与M2型巨噬细胞比例失衡。然而在此过程中，GPR97基因敲除小鼠与野生型小鼠相比，其代谢功能并没有显著差异[32，33]。

综上所述，aGPCRs不仅可作为巨噬细胞的表面标记并介导其吞噬作用，而且还可以诱导巨噬细胞释放炎症因子参与免疫过程。大量研究已经证实，抑制巨噬细胞表面aGPCRs的表达或活性能有效减轻炎症反应和巨噬细胞介导的自身免疫性疾病。因此，随着对以巨噬细胞为靶点治疗的免疫机制的深入研究，可以为炎症性疾病的临床治疗与用药提供新的思路和方法。