急性髓系白血病患者骨髓单个核细胞中EZH2、PTEN mRNA表达及其相关性

李乾鹏，冉学红，朱旭，刘洋，盛志新，刘丽萍

(潍坊市人民医院，山东潍坊261000)

急性髓系白血病(AML)是一组高度异质性、源于白血病干细胞的恶性克隆性疾病群[1]。随诊疗技术的提高，AML患者预后得到很大改善，但因AML易复发和耐药，导致现阶段治疗失败率较高[2]。对AML复发耐药机制深入研究，有助于探索更有效的诊疗手段。果蝇zeste基因增强子同源物2(EZH2)[3,4]具有组蛋白甲基转移酶的活性，在多种恶性实体肿瘤(如卵巢癌、胃癌等)中高表达，且与预后不良相关[4～6]。新近报道显示，血液系统恶性肿瘤中EZH2呈高表达，并且EZH2高表达多发生在高危患者[3]，提示EZH2参与血液系统恶性肿瘤的发生发展。张力蛋白同源的10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)是一种具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因，位于10号染色体上[7]。PTEN可使PIP3去磷酸化，调节细胞的增殖与存活[8]。PTEN在肿瘤组织中低表达，是某些肿瘤(如膀胱癌、胃癌等)诊断及预后的重要参考指标。研究表明，PTEN表达或活性水平微量降低可导致肿瘤易感性增强[8]。另有报道显示，PTEN表达缺失可促进白血病干细胞产生[8,9]。由此可见，PTEN在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。为探讨EZH2、PTEN在AML发生发展中的作用，本研究采用实时荧光定量PCR法检测AML患者骨髓单个核细胞中的EZH2、PTEN mRNA表达，并分析EZH2 mRNA与PTEN mRNA表达的相关性，为AML的诊疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 骨髓单个核细胞来源 选取潍坊市人民医院血液科2014年3月～2015年3月收治的AML患者60例纳入AML组，其中男29例、女31例，年龄16～82(47.24±7.91)岁。AML诊断标准参照《血液诊断及疗效标准第3版》。另选择因贫血、不明原因出血等行骨髓穿刺检查者20例为正常对照组。本研究经医院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。采集两组研究对象的骨髓液5 mL，无菌条件下EDTA抗凝处理，加入红细胞裂解液，室温静置10 min，1 300 r/min离心10 min，PBS洗涤2次，获得骨髓单个核细胞。

1.2 骨髓单个核细胞中EZH2、PTEN mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。用TRIzol提取骨髓单个核细胞总RNA，检测总RNA纯度，逆转录为cDNA，进行PCR反应。PCR反应体系参照Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒配置。反应条件为94 ℃反应5 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共计40个循环终止反应；在PCR循环第二步60 ℃时收集荧光信号，设空白对照。内参β-actin上游引物序列为5′-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3′，下游引物序列为5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3′；人EZH2基因上游引物序列为5′-GACCCTGACCTCTGTCTTACTT-3′，下游引物序列为5′-GATGGTGCCAGGCAATAGATG-3′。人PTEN上游引物序列为5′-CTATTCCCAGTCAGAGGCGCTAT-3′，下游引物序列为5′-TGAACTTGTCTATCCCGTCGTGT-3′。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 AML组及正常对照组骨髓单个核细胞中EZH2、PTEN mRNA表达比较 AML组及正常对照组骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA相对表达量分别为284.8±15.9、100.0±7.2，AML组及正常对照组骨髓单个核细胞中PTEN mRNA相对表达量分别为30.8±3.6、103.0±7.5。AML组骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA相对表达量高于正常对照组，PTEN mRNA相对表达量低于正常对照组(P均<0.01)。

2.2 AML患者骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA、PTEN mRNA表达的相关性 AML患者骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA与PTEN mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.694，P<0.05)。

3 讨论

AML是严重威胁人类健康的造血系统恶性克隆性疾病[1,10]。AML的发病率逐年增加，且5年生存率小于50%[2,10]。化疗作为AML的主要治疗手段，已取得较大进展，但由于耐药现象的存在，多数患者仍出现难治、复发，最终导致治疗失败[11]。表观遗传学变异在白血病的复发耐药中具有重要作用。白血病细胞耐药的主要机制包括DNA损伤修复异常、细胞周期紊乱、细胞凋亡逃逸、药物代谢干扰、药物靶点变异、药物转运障碍等。

EZH2基因位于染色体7q35，是PcG复合物的核心组成部分[12]。EZH2可三甲基化组蛋白H3的27位赖氨酸，发挥基因沉默的生物学效应；亦可通过甲基化依赖的泛素化机制降解RORα，沉默相关基因[3]。另外，EZH2也有基因活化的作用，如通过与β-catenin、ERα相互作用，导致ERα/β-catenin/Wnt通路活化，通过与RelA/RelB相互作用激活NF-κB[13,14]。EZH2在多种肿瘤的发生发展及肿瘤细胞的转移、侵袭、耐药中发挥重要作用，主要机制包括miRNA沉默、肿瘤免疫逃逸、非经典转录调节等[15]。在血液系统中，EZH2对维持造血干细胞的自我更新、分化有重要意义[13]。EZH2在AML、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等恶性血液系统疾病中异常表达，且高表达EHZ2的患者预后差、易复发[16]。在血液系统疾病中，EZH2表现出双重作用，如在弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤中，EZH2存在功能获得性突变；而在骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常综合征/骨髓增殖性肿瘤、骨髓纤维化中，EZH2表现出功能缺失性突变[3]。

PTEN有9个外显子和8个内含子，其编码的蛋白在胞质中表现出双重特异性磷酸酶活性，即蛋白酪氨酸磷酸酶活性和脂质磷酸酶活性[8]。在分子遗传学水平，PTEN通过调控重要的信号通路与细胞代谢过程影响细胞基因的稳定性。在细胞水平，PTEN在干细胞的自我更新、细胞周期等方面具有重要作用[17]。在前列腺组织中，PTEN表达缺失导致肿瘤细胞增殖和肿瘤发生；在胚胎神经干细胞，PTEN表达缺失可促进干细胞的自我更新及加速细胞周期从G0期向G1期进展[8]。在血液系统，PTEN缺失可导致正常造血干细胞过度增殖并演变为白血病干细胞[17,18]。白血病干细胞中PTEN表达缺失导致干细胞基因不稳定，如β-catenin激活、Myc基因过表达等癌基因表达异常，上述癌基因异常表达又进一步促进白血病干细胞增殖，以此形成恶性反馈[8]。除此之外，PTEN缺失还可激活JAK2/STAT3通路及促进肿瘤微环境中免疫抑制因子的释放，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸[8]。因此，PTEN是一种重要的抑癌基因，其正常表达能够抑制细胞过度增殖、促进细胞生理性凋亡、减少DNA损伤并抑制肿瘤细胞的代谢[8]。“胞核池”中PTEN表达水平对于维持细胞基因稳定性至关重要；PTEN表达缺失会导致细胞基因的完整性受损[8,19]，出现原癌基因(如Myc)过表达及抑癌基因(如p53)低表达或缺失，促进肿瘤的发生发展与复发耐药。

本研究结果显示，AML组骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA相对表达量高于正常对照组，PTEN mRNA相对表达量低于正常对照组；AML患者骨髓单个核细胞中EZH2 mRNA与PTEN mRNA表达呈负相关。这提示EZH2和PTEN与AML的发病有关，且二者之间可能存在一定的相互作用。我们推测，PTEN表达缺失可能是肿瘤发生的诱发因子。低水平的PTEN导致细胞中重要的癌基因EZH2稳定性减低，导致EZH2过度表达，进而参与AML的发病。我们先前研究发现促癌因子EVI1 mRNA在AML患者中高表达，PTEN mRNA在AML患者中低表达，二者亦呈负相关[20]，推测在AML中PTEN缺失导致癌基因EZH2与EVI1突变，二者过度表达，最终诱发AML的发生发展。在此过程中是否有其他基因参与仍需要进一步验证。关于PTEN与EZH2、EVI1之间的相互作用及其机制也有待研究证实。