甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织及血清中miR-1296表达变化及意义

季昳弛，乔德辉，周翔宇，何雪梅，杨辉，程炼

(西南医科大学附属医院，四川泸州646000)

甲状腺肿瘤是最常见的内分泌肿瘤之一。甲状腺肿瘤分为良、恶性，其中约80%的恶性甲状腺肿瘤为甲状腺乳头状癌(PTC)[1～4]。大部分PTC预后较好，仍有部分患者术后复发及远处转移。目前术前诊断PTC的金标准是细针穿刺活检(FNA)，然而受肿瘤大小、位置、性质和操作人员水平等影响，约有30%的样本不能确诊。因此，寻找PTC诊断、术前风险评估、监测复发的标志物有重要意义[5]。微小RNA(miRNA)是长度为18～22 bp的非编码单链RNA，在转录后水平上调节基因表达。miRNA与PTC发生、进展密切相关。研究发现，miR-146-5p、miR-199a-5p、miR-199b-5p等与PTC的生长有关，可协助FNA诊断[6]。Lee等[7]发现，miR-222、miR-146b与PTC的进展及复发相关。研究表明，miR-9和miR-21在PTC术后复发患者中表达降低，二者有望作为监测肿瘤复发的标志物[8]。文献报道，在三阴性乳腺癌中，miR-1296能抑制细胞增殖并增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性[9]。miR-1296还被发现在前列腺癌组织中表达下调，导致处于细胞周期S期的细胞比例减少[10]。本研究观察了miR-1296在PTC患者肿瘤组织及血清中的表达变化，分析miR-1296表达与PTC临床病理参数的关系，并初步探讨miR-1296对PTC发生发展的影响机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 PTC组织及血清样本来源 选取2015年6月～2016年6月于西南医科大学附属医院行手术治疗的甲状腺肿瘤患者65例，其中PTC 30例、良性肿瘤35例。PTC患者中，男11例，女19例；年龄>45岁 17例，≤45岁13例；肿瘤直径>2 cm 15例，肿瘤直径≤2 cm 15例；单发肿瘤17例，多发肿瘤13例；T1期12例，T2～4期18例；N0期13例，N1期17例；ASA风险分级低危组19例，中高危组11例；经典型PTC 26例，滤泡型PTC 4例；血清中甲状腺球蛋白水平>77 ng/mL者16例，≤77 ng/mL者14例。良性肿瘤患者中，男10例，女25例；年龄>45岁15例，≤45岁20例；肿瘤直径>2 cm 12例，肿瘤直径≤2 cm 23例。术中取离体肿瘤组织及距肿瘤>1 cm的正常甲状腺组织于液氮中速冻，-80 ℃保存。另选择35例行甲状腺手术的PTC患者，分别于术前1 d及术后1 d采集促凝外周血，离心取上清，-80 ℃保存。本研究经西南医科大学附属医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 PTC组织及血清miR-1296检测 采用实时荧光定量PCR法。取100 mg组织在液氮中研磨成粉末，提取总RNA，检测总RNA浓度及纯度，琼脂凝胶电泳成像检测RNA完整性。取200 μL血清样品，按照QIAGEN miRNeasy serum/plasma Kit试剂盒说明书提取血清RNA。分别取500 ng组织RNA或6 μL血清RNA，按照miScript Ⅱ RT kit试剂盒说明书逆转录合成cDNA。组织PCR反应步骤：95 ℃ 15 min;然后95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，共40个循环。血清PCR反应步骤：95 ℃ 15 min；然后94 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，共5个循环；94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40个循环。组织检测以U6作为内参，血清检测以cel-miR-39作为内参。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量。

1.3 miR-1296的生物学信息分析 通过Targetscan预测miR-1296靶基因，GEPIA分析TCGA、GTEx数据库中甲状腺癌基因表达变化。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。符合正态分布的计量资料采用独立样本t检验，不符合正态分布的计量资料采用秩和检验。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清miR-1296对PTC的诊断价值，用MedCalc软件分析ROC曲线下面积(AUC)及最佳截断值。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC组织、良性肿瘤组织及癌旁正常甲状腺组织中miR-1296表达比较 PTC组织、良性肿瘤组织及癌旁正常甲状腺组织中miR-1296相对表达量分别为0.61±0.12、0.62±0.11、1.59±0.38。PTC组织、良性肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于癌旁正常甲状腺组织(P均<0.05)。

2.2 miR-1296表达与PTC临床病理参数的关系 肿瘤直径>2 cm者肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于肿瘤直径≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于Ⅰ期者(P均<0.05)。详见表1。

2.3 PTC患者手术前后血清miR-1296表达比较 患者手术前后血清miR-1296表达量分别为1.12±0.98、6.02±1.92。术后血清miR-1296表达量较术前增高(P<0.05)。

2.4 血清miR-1296对PTC的诊断效能 ROC曲线分析显示，血清miR-1296诊断良性肿瘤和PTC的AUC分别为0.780、0.790。血清miR-1296诊断良性肿瘤的敏感度为81%，特异度为71%；诊断PTC的敏感度为64%，特异度为86%。见图1。

表1 miR-1296相对表达量与PTC临床病理参数的关系(M)

图1 血清miR-1296诊断PTC的ROC曲线

2.5 miR-1296对PTC发生发展的作用机制 Targetscan预测发现，MAP17可能是miR-1296的靶基因；GEPIA分析TCGA及GTEx数据库中甲状腺癌基因表达，发现MAP17在甲状腺癌中的表达升高。推测miR-1296可能通过负性调控MAP17表达，参与PTC的多个生物学过程。

3 讨论

PTC是起源于甲状腺滤泡细胞的恶性肿瘤，近年来其发病率明显升高[11]。虽然PTC的手术效果很好，但仍有少数患者出现局部复发或远处转移。超声引导的FNA通常用于检测原发性、转移性病变及复发性病变。PTC患者术后管理的目的是早期发现肿瘤复发[12]。目前超声、CT、FDG-PET/CT检查可用于检测转移性病变或复发，但这些检查手段费用较高且耗时。寻找PTC的血清学标志物有助于解决这一问题[13]。

miRNA在人肿瘤形成和进展中具有重要作用。多种miRNA在恶性肿瘤组织中异常表达或缺失[14]。某些特定miRNA可预测人类恶性肿瘤的恶性程度和临床结局。许多癌基因或抑癌基因受miRNA调节网络的靶向调节[15]。miRNA具有肿瘤促进和肿瘤抑制活性，miRNA靶向治疗有望成为恶性肿瘤治疗的新方案。此外，miRNA编码基因常受到遗传改变(包括染色体重排和点突变)的影响，这种miRNA靶向遗传改变已经被认为是恶性肿瘤的特异性标签[15]。因此，miRNA表达谱有望用于肿瘤诊断和预后评价。

已有文献报道，miR-1296参与了多种肿瘤的发生发展。Tao等[16]认为miR-1296可能参与了结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。Xu等[17]研究发现，miR-1296通过靶向作用于SRPK1介导的PI3K/AKT途径抑制肝细胞癌的转移和上皮-间质转化。Phan等[18]发现miR-1296在三阴性乳腺癌中发挥着肿瘤抑制因子的作用。而关于miR-1296在PTC中的表达报道较少。本研究结果显示，PTC组织、良性肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于癌旁正常甲状腺组织；肿瘤直径>2 cm者肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于肿瘤直径≤2 cm者，TNM分期Ⅱ～Ⅳ期者肿瘤组织中miR-1296相对表达量低于Ⅰ期者。这提示miR-1296低表达可能参与了PTC的发病，并与PTC的进展有关。对PTC患者血清miR-1296进行检测发现，术后血清miR-1296表达较术前增高，血清miR-1296对PTC的诊断敏感度为64%、特异度为86%，提示血清miR-1296检测对PTC有一定的诊断效能。此外，我们还分析了miR-1296与肿瘤亚型、ASA分级、性别、甲状腺球蛋白、病灶数目的关系，但未得出有统计学意义的结果，可能与样本量较少有关。

现已报道的miR-1296靶基因有SRPK1、KEGG等[16，17]。miRNA调节网络非常复杂，一个miRNA可结合多个靶基因，且在不同条件下可结合不同的靶基因[18]。我们通过生物信息学分析发现MAP17的3′ UTR区与miR-1296存在15个结合位点。MAP17(DD96，PDZKIP1)是一种相对分子质量17 kD的非糖基化的膜相关蛋白，其过表达于结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种人类肿瘤中。MAP17与肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、远处转移、耐药等密切相关[19]。我们通过分析发现miR-1296与MAP17存在结合位点，二者表达呈负相关，提示在PTC中miR-1296可能通过靶向作用于MAP17发挥生物学功能。

结合上述研究结果，我们认为，miR-1296在PTC患者肿瘤组织及血清中表达降低，与PTC的发病和进展有关；miR-1296可能通过对其靶基因MAP17的负性调控抑制PTC的发生与进展。但本研究样本量较少，后期我们还需进一步加大样本量、深入分析以验证上述结论。