矢车菊素-3-葡萄糖苷对人原代成骨细胞迁移能力的影响及其可能机制

胡博森，周波，张卓，王晓红，陈拥

(1沈阳医学院公共卫生学院，沈阳110034；2沈阳医学院附属中心医院)

骨质疏松症及其导致的骨折是影响老年人生活质量的主要慢性疾病之一。骨质疏松症成因与骨组织中的成骨细胞成骨能力下降有关。据报道属于花色苷类的矢车菊素-3-葡萄糖苷(C3G)有预防骨质疏松症的作用，其潜在的作用机制包括抑制破骨细胞功能及促进成骨细胞分化[1]。目前研究多集中在C3G对破骨细胞的抑制作用，而关于其对成骨细胞调节作用的研究较少。研究[2]表明，C3G可抑制某些细胞的迁移能力。如C3G联合阿托伐他汀可拮抗血管内皮紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移；肝脏纤维化模型中，C3G对肝星状细胞迁移具有抑制作用[3]。另外，C3G还能抑制乙醇诱导的过表达ErbB2型乳腺癌细胞的迁移和侵袭[4]。成骨细胞迁移对骨形成和骨折愈合具有重要作用[5]，但C3G对成骨细胞迁移能力的影响未见报道。骨质疏松性骨折好发于髋部，使用人髋部松质骨来源的原代成骨细胞模型对花色苷类物质抗骨质疏松症研究具有重要意义。2017年5月～2018年4月，本研究拟取髋部骨来源的人原代成骨细胞，观察C3G对成骨细胞迁移能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 C3G购自大连美仑生物技术有限公司，批号M86905。改良型最低必需培养基(α-MEM)、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS)、青霉素-链霉素、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司。红细胞裂解液(碳酸氢钠840 mg、乙二胺四乙酸37.2 mg、氯化铵8.023 g、双蒸水定容至1 000 mL，调节pH至7.2)、酶消化液(胶原酶5 g/L、透明质酸酶2.5 g/L)均购自上海生工生物工程股份有限公司。瑞氏-姬姆萨染色试剂盒、茜素红染色试剂盒购自南京凯基公司。TRIzol试剂、mRNA反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。CO2培养箱(BB-15，美国赛默飞世尔)、实时荧光定量PCR仪(7500FAST，美国ABI)、超净工作台(HD-1360，北京东联哈尔)、倒置显微镜(CKX31，日本奥林巴斯)。

1.2 人成骨细胞的获取及分组 实验方案经沈阳医学院伦理学委员会批准，被取材患者均签属知情同意书。标本取自股骨头置换术患者，剪取松质骨组织，使用胶原酶消化法提取原代成骨细胞。在含有10% FBS的α-MEM培养基中培养，培养条件37 ℃、5% CO2、饱和湿度。细胞生长接近融合时按1∶2传代。培养14 d时加入含有10 mmol/L的β-甘油磷酸钠和50 mg/L的抗坏血酸的完全培养液以诱导矿化。诱导结束后用乙醇固定细胞，进行瑞氏-姬姆萨复合染色和茜素红染色并拍照保存。茜素红染色以镜下见红染结构为阳性。瑞氏-姬姆萨复合染色结果显示原代成骨细胞贴壁生长，呈长梭形、多角形或多树突状，胞质丰富，细胞内单核；高倍镜下可观察到细胞呈层叠生长趋势，低倍镜下细胞呈“涡轮”状生长；经诱导矿化后，细胞聚集处可观察到大小不一的红染结构，即成骨细胞钙化点。继续培养至28 d，将获得的成骨细胞分为C3G组和对照组。

1.3 细胞迁移能力观察 采用划痕实验。将成骨细胞以5×105/皿接种至直径60 mm的培养皿中，24 h后更换为无血清培养基，继续培养24 h后吸弃培养基，使用1 000 μL枪头在培养皿表面划线。划痕后将C3G组培养基更换为含100 μmol/L的C3G的无血清α-MEM培养基；对照组培养基中不含C3G，其余培养条件与C3G组相同。分别于划痕后0、6、24、54 h在倒置显微镜下选取宽度适宜、划痕两侧均匀、视野良好的区域进行拍照，照片通过后期裁剪和调整保证相对位置一致。以划痕两侧细胞经移动后相互接触所需时间评估细胞的迁移能力。

1.4 细胞中骨桥蛋白(OPN)mRNA检测 将成骨细胞以1.5×106/皿接种至直径100 mm的培养皿中，24 h后更换为无血清培养基，继续培养24 h后吸弃培养基。将C3G组培养基更换为含100 μmol/L的C3G的α-MEM完全培养基；对照组培养基中不含C3G，其余条件与C3G组相同。继续培养细胞24 h后提取总mRNA，采用实时荧光定量PCR法检测成骨细胞中的OPN mRNA，按试剂盒说明书进行操作。目的基因引物及内参GADPH引物的设计和合成均由上海生工生物工程股份有限公司完成。OPN基因上游引物序列为5′-CCACAGCCACAAGCAGTCCAG-3′，下游引物序列为5′-TCCTGACTATCAATCACATCGGAATGC-3′。扩增条件为95 ℃ 30 s，(95 ℃ 3 s变性，60 ℃ 30 s退火/延伸)×40个循环。以2-ΔΔCt表示OPN mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞划痕后愈合能力比较 如图1所示，划痕后6 h，对照组划痕边缘细胞开始移动，而C3G组无此现象，仅可见因划痕而破碎的细胞形态发生略微改变；划痕后24 h，对照组细胞有向划痕区域迁移的明显趋势，C3G组细胞仅发生轻微移动；划痕后54 h，对照组划痕两侧细胞接触，划痕已无法明确分辨，C3G组细胞则刚刚呈现迁移趋势，截至本次观察终点C3G组细胞划痕未能愈合。

2.2 两组细胞中OPN mRNA表达比较 对照组、C3G组细胞中OPN mRNA相对表达量分别为1.04±0.28、0.26±0.22，C3G组细胞中OPN mRNA相对表达量低于对照组(P<0.05)。

注：a、b、c、d分别为对照组划痕后0、6、24、54 h细胞迁移情况；e、f、g、h分别为C3G组划痕后0、6、24、54 h细胞迁移情况。

3 讨论

花色苷是一类天然植物色素，具有抗炎抗氧化和抗骨质疏松活性[6]。C3G是一种常见的花色苷[7]。据报道，C3G具有抗骨质疏松活性，可抑制破骨细胞成熟并促进成骨细胞分化，但机制尚未明确[8～10]。在成骨细胞行使骨质合成功能的过程中，细胞迁移至关重要。骨形态发生早期前成骨细胞受多种趋化因子调节从而向特定区域迁移并启动分化进程；骨折修复的起始阶段即成骨细胞、破骨细胞向骨折部位迁移；骨形态发生的中晚期成骨细胞经由被动捕获机制向成熟的骨细胞转变，包括成骨细胞合成类骨质并自埋或被相邻细胞嵌入，迁移能力下降、完成骨盐沉积等[11]。现已证实，花色苷类物质可在体内外抑制某些细胞迁移。例如：葡萄花色苷可拮抗组织蛋白酶L介导的前列腺癌细胞和乳腺癌细胞的迁移、侵袭[12]；口服黑米花色苷可抑制荷瘤BALB/c裸鼠体内接种的ErbB2阳性乳腺癌细胞株MDA-MB-453的转移[13]；在非肿瘤细胞模型中，C3G可通过抑制肝星状细胞迁移从而抗肝脏纤维化[3]。

本研究使用人原代成骨细胞，研究采取的原代细胞提取方案能够成功提取原代成骨细胞样本。细胞划痕实验是观察细胞迁移能力的经典实验方法。本研究结果显示，划痕后3、6、24、54 h，对照组细胞不断向划痕处迁移，C3G组迁移速度明显减慢，划痕愈合时间延长，提示C3G可抑制成骨细胞的迁移。C3G分子的黄酮骨架上结合了多个酚羟基，酚羟基数目是花色苷类物质抗氧化能力和稳定性的重要影响因素。C3G的抗氧化能力最强但稳定性较差[14]，因此在划痕后54 h时C3G组细胞迁移能力开始恢复的原因可能与培养基中有效的C3G成分减少有关。

OPN是成骨细胞分化早期的重要蛋白，是一种多功能的基质细胞蛋白，被认为在伤口愈合和细胞对机械应力的反应中起关键作用。OPN具有趋化成骨细胞向骨折等部位迁移的能力，是诱导机械应力引起的骨重建的重要因素。OPN参与成骨细胞的移动过程，在间充质细胞分化早期表达。研究显示，间充质干细胞启动成骨分化进程的早期，OPN表达量提高10倍以上，细胞出现明显的迁移活动。OPN除在骨组织中发挥重要作用外，还与多种细胞的迁移活动有关。OPN在肺纤维化发展过程中发挥了重要作用。在某些肿瘤细胞的诱导迁移和侵袭模型中亦可观察到OPN高表达现象[15,16]。有学者[17]指出，OPN不仅能促进成骨细胞的迁移，还是单核细胞迁移的重要趋化因子，这意味着OPN具有潜在的调节破骨细胞的作用。骨折愈合过程中，OPN蛋白可能是诱导间充质干细胞迁移的重要趋化因子，在缺氧骨细胞模型中使用OPN抗体可拮抗细胞的迁移作用[18]。本研究中，C3G组细胞中OPN mRNA相对表达量明显低于对照组，我们推测C3G可能通过下调OPN基因表达从而抑制成骨细胞的迁移能力。OPN表达下降对成骨细胞成熟具有积极意义，但在骨折愈合早期OPN表达水平下降可能会影响骨折愈合进程的启动。此外，人群研究报告指出糖尿病患者血清高水平的OPN与低骨密度及高骨质疏松风险相关[19]。尽管尚不能确定OPN蛋白表达和骨折风险之间的因果关系，但本研究结果为C3G抗骨质疏松症的机制研究提供了新的思路。Liu等[20]报道OPN促进胃癌细胞迁移和侵袭依赖促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K途径)；Pantan等[2]也发现，C3G在人血管平滑肌细胞模型中抑制细胞迁移能力同样依赖MAPK和PI3K途径。本研究中，C3G抑制成骨细胞迁移及抑制OPN表达的作用是否与MAPK、PI3K途径有关，仍有待后续研究验证。