缺血后处理对缺血再灌注大鼠心脏凋亡相关酶活性的影响*

洪 勇

安徽卫生健康职业学院医学技术教研室 池州 247099

缺血再灌注损伤是指心肌组织血供中断后采用溶栓等治疗措施在恢复缺血区血供的同时进一步加剧损伤并引起心脏功能障碍的现象。这一现象给缺血性心肌病的治疗增加了困难。2003年有学者首次提出缺血后处理这一手段[1]，即再灌注前给予多次短暂再灌注/缺血过程，能明显减轻复灌造成的心肌组织损伤。本研究采用冠状动脉结扎的方法[2]制备大鼠心肌缺血再灌注模型并观察缺血后处理对心肌细胞凋亡及凋亡相关酶活性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠体质量(220±20)g，购于青龙山动物繁殖场。

1.2 试剂 原位末端标记法(TUNEL)染色试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司；Caspase 3活性检测试剂盒、Caspase 9活性检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自南京南京建成生物工程研究所。

1.3 分组及模型制备 30只大鼠随机分为模型组、假手术组、缺血后处理组，每组10只。大鼠经戊巴比妥钠(30 mg/kg)ip 麻醉后连接小动物呼吸机进行人工呼吸。开胸暴露心脏，结扎冠状动脉左前降支40 min，以心电图显示 ST段明显抬高、T波高耸表示模型制备成功。再灌注2 h前给予5个循环的缺血/再灌注后处理(10s/10s)。假手术组只穿线不结扎。

1.3.1 HE染色 将各组大鼠心脏石蜡块切片、常规脱蜡至水，HE染色，光镜下观察心脏病理学变化。

1.3.2 TUNEL染色 心肌组织固定、石蜡包埋、切片后，按试剂盒说明书染色。光镜下观察，每张切片随机选择6个视野，计数凋亡阳性及阴性细胞数，计算凋亡率。

1.3.3 酶活性检测 酶标仪分别测定心肌组织匀浆Caspase-3 及 Caspase-9活性，具体步骤见试剂盒说明书。心肌匀浆蛋白含量测定采用Bradford法。

1.3.4 T-AOC及MDA水平检测 酶标仪分别测定心肌匀浆T-AOC及MDA水平，具体步骤见试剂盒说明书。心肌匀浆蛋白含量测定采用Bradford法。

2 结果

2.1 缺血后处理对大鼠心肌组织病理组织学影响 光镜下可见，假手术组大鼠心肌细胞结构完整，染色均匀，胞核居于细胞中央。缺血再灌注大鼠部分可见心肌纤维断裂，细胞水肿、变性、坏死。缺血后处理组大鼠心肌细胞轮廓完整，胞质轻度水肿，心肌细胞变性、坏死较少(图1)。

A 假手术组；B 缺血再灌注模型组；C 缺血后处理组。

图1 大鼠心肌组织HE染色(×400)

2.2 缺血后处理对大鼠心肌细胞凋亡的影响 假手术组大鼠心肌未见明显细胞凋亡(图2)；缺血再灌注组大鼠心肌细胞凋亡显著增加(P<0.01)，缺血后处理组大鼠心肌细胞凋亡数明显减少(P<0.05)(表1)。

A 假手术组；B 缺血再灌注模型组；C 缺血后处理组。

图2 大鼠心肌组织TUNEL染色(×400)

组别凋亡率/%假手术组3.42±0.47模型组33.68±7.76**缺血后处理组24.00±5.33#

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

2.3 缺血后处理对大鼠心肌组织Caspase-3 及 Caspase-9活性的影响 与假手术组相比，缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡率升高的同时，Caspase-3 及 Caspase-9活性显著升高(P<0.01)，缺血后处理组大鼠心肌组织上述指标明显降低(P<0.05)(表2)。

表2 缺血后处理对大鼠心肌组织Caspase-3 及Caspase-9活性的影响

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 缺血后处理对大鼠心肌组织TAOC 及 MDA水平的影响 缺血再灌注大鼠心肌总抗氧化能力明显降低，MDA水平明显升高(P<0.01)，缺血后处理明显提高心肌抗氧化能力，减少脂质过氧化产物MDA水平(P<0.05)(表3)。

表3 缺血后处理对大鼠心肌组织TAOC 及MDA水平的影响

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3 讨论

缺血再灌注损伤往往继发于急性心肌梗死溶栓治疗、冠状动脉成形术、心脏外科体外循环等治疗过程中。研究表明，再灌注可通过激活氧化应激、Ca2+超载、炎症等[3-4]途径诱发心肌细胞凋亡，从而造成缺血组织进一步损伤。阻断细胞凋亡的发生，对维持或改善心功能有积极意义[5]。本实验通过HE染色和TUNEL染色观察到：经过2 h缺血和40 min复灌后，心肌组织出现部分肌纤维断裂，细胞水肿、变性，细胞凋亡率明显升高。而复灌前给予5次短暂再灌注/缺血处理则明显减轻上述损伤效应。

文献报道氧化应激介导的线粒体凋亡途径在心脏缺血再灌注损伤中扮演重要角色[6-7]。Caspase是细胞线粒体凋亡的关键蛋白酶，其中Caspase 9是 Caspase级联反应的起始因子，活化后可以激活线粒体凋亡途径。Caspase 9通常以酶原形式存在，在凋亡因子等的刺激下，形成二聚体，激活下游的Caspase 3，活化的 Caspase 3能够抑制抗凋亡蛋白、DNA修复因子等功能的发挥，诱导细胞凋亡[8-9]。我们检测了各组大鼠心肌组织Caspase 3、Caspase 9酶活性以及氧化应激指标，发现缺血再灌注组大鼠心肌Caspase 3、Caspase 9酶活性相较于假手术组大鼠显著升高，这与文献报道[10]一致。同时总抗氧化能力降低，脂质代谢产物MDA水平升高。缺血后处理明显减轻再灌注造成的氧化损伤及凋亡酶激活。由此推测缺血后处理可能通过抑制氧化应激诱导的凋亡相关蛋白酶活性来减轻缺血再灌注造成的大鼠心肌细胞损伤。