明胶诱导类釉质样氟磷灰石合成及其微观形貌研究

董志恒 张玉静 高玉光 王青山 韩晓谦

滨州医学院附属医院口腔科 滨州 256603

牙釉质是人体骨质中最坚硬的部分，主要由羟基磷灰石的结晶体和少量的氟磷灰石(Fluorapatite，FA)还有钠、钾、镁的碳酸盐等化学成分组成[1]。临床上常见的疾病如龋坏、磨耗、外伤等可导致不可逆的牙体硬组织缺损，因此恢复牙齿形态及功能是口腔科医生临床工作的重要任务。目前临床上常用的修复牙体组织缺损的方法有充填术、嵌体修复、冠修复等，但这些方法均需损伤牙体组织且修复材料无论在结构、组成还是本身的性质上都与牙体组织相差较远，因此体外在仿生构建类釉质样结构用于修复牙体硬组织缺损是目前国内外研究的热点问题[2-6]。目前常见的方法有重组釉质蛋白[1]、利用表面活性剂[2-3]等方式模拟生物矿化的过程，或利用简单的化学合成方法[4]来重建表面釉质层，然而这些方法未能成功合成类釉质样结构，且由于合成条件苛刻不能适用于临床。目前有研究已明确仿生矿化是构建人工晶体的一种有效方法，本文即利用明胶作为大分子有机基质，构建类釉质样FA，研究FA晶体在不同反应时长下其微观形态的变化，预期合成一种形态可控，微观形貌与牙釉质具有高度的统一性的晶体，为牙体硬组织缺损修复提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 FA晶体制备 溶液A: 20 mL去离子水中，加入HEDTA 0.557 g与无水氯化钙0.222 g，60℃恒温，磁力搅拌器上搅拌4 h。溶液B: 向溶液A中加入一定量的明胶粉末，静置1 h，60℃水浴。溶液C:向溶液B中加入Ca∶P∶F=5∶3∶1的NaH2PO4·2H2O 0.187 g，pH值调至6.5；加入 0.02 M NaF溶液，搅拌3 h，37℃恒温水浴1周，离心、冲洗3次，60℃烘箱中烘干。

1.2 FA晶体性能表征

1.2.1 显微结构分析 采用扫描电镜(SEM)观察FA晶体1、3、5、7 d的显微结构的变化。

1.2.2 物相分析 采用X射线衍射仪观察其特征性峰。

1.2.3 红外光谱分析 采用Nicolet Avatar 370型傅立叶变换红外光谱仪( FTIR)分析晶体化学构成。

1.2.4 能谱分析 采用X光电子能谱(XPS) (VG ESCALAB MKII)检测样品中的钙磷比例及氟含量。

2 结果

2.1 晶体微观形貌分析

2.1.1 FA晶体形貌 反应1 d，可见球样结构颗粒聚集，未见晶体形成(图1a)。反应3 d，可见晶体成簇聚集，长的可达4～6 μm，短的约为2～4 μm，晶体横截面直径约400～600 nm(图1b)。反应5 d，可见到长梭形晶体样结构，且聚的更为紧密，长度增加达7 μm左右，横截面直径有1 μm(图1c、d)。反应7 d，可见更为紧密的成簇聚集的晶体，且高倍镜下可观察到长梭形晶体结构是由许多平行排列的小晶体组成(图1e、f)。

a为反应1 d；b为反应3 d；c、d为反应5 d；e、f为反应7 d。

图1 FA晶体随反应时间延长的SEM照片

2.1.2 明胶基质下FA晶体形貌 反应3 d，可见溶液中花瓣样形态的晶体(图2a)；反应5 d，可见晶体相互聚集融合，形成纺锤状，晶体长度约为6～8 μm，横截面直径约为250 nm六棱柱样结构(图2b)；反应7 d，逐渐转变成规则六棱柱晶体结构，其横截面直径增加达到500 nm，长度可达约9～10 μm(图2c、d)。

a为反应3 d；b为反应5 d；c、d为反应7 d。

图2 明胶分子基质下FA晶体SEM照片

2.2 XRD分析 XRD结果显示：FA晶体在2θ=25.9、28.2、29、32.9、33.5、38.8、40、47.6、49.8、55.2°出现特征峰，未见其他杂质的峰位(图3)。说

a为明胶存在下FA晶体XRD图像； b为无明胶存在下FA晶体XRD图像

图3 FA样品的XRD图像

明构建材料中含有FA，有明胶存在的FA晶体其特征峰值较密集，宽度变大，半高宽度变小，说明明胶的存在促进FA晶体的成熟，随着时间延长FA特征峰不断减弱，说明晶体矿化成核结束(图4)。

a为反应3 d； b为反应5 d； c为反应7 d

图4 不同时间条件下FA样品的XRD图像

图5 FA样品的FT-IR图像

2.4 样品基本元素组成分析 通过XPS提供的数据显示，晶体主要由Ca、P和少量的F元素构成，与天然釉质组成部分类似(图6)。在无明胶分子存在的条件下，制备的FA的Ca/P比为1.37，而在明胶存在的条件下制备的FA的Ca/P比值为l.577(表1)。

表1 样品中元素的百分含量

a 为明胶存在条件下FA晶体XPS图； b为无明胶条件下FA晶体XPS图。

图6 FA样品的XPS图谱

3 讨论

牙体硬组织缺损是临床常见病，其主要组成部分牙釉质结构一旦破坏不能再生，其矿化过程极其复杂，在细胞外基质蛋白的调控作用下矿物质定点成核，并有序生长[7-12]，其机理为：细胞外基质蛋白主要为秞原蛋白，其组成结构中含有许多官能团，如：天冬氨酸、谷氨酸等，在釉质矿化过程中可以与钙离子结合，促使釉质不断成熟[13]。因此本实验模拟牙釉质的矿化过程，采用仿生矿化构建FA晶体，预期达成牙体硬组织的再矿化，目前釉质仿生矿化的方式主要有：共沉淀法、模拟体液矿化法，生物仿生矿化、蛋白诱导矿化法、自组装技术等，其中生物仿生矿化最接近天然釉质的矿化方式，主要是利用胶原、壳聚糖等大分子有机材料做模板，加入F离子后诱导有机物和无机物的有序聚合，该过程可以自组装，有序组装，定点矿化等优点，同时保证了FA晶体成核的必要条件，促使FA晶体延C轴生长[14-15]。

明胶是细胞外基质蛋白的主要组成部分，由三条多肽链构成，其中和骨组织相关的是Ⅰ型胶原蛋白，其生物相容性良好，稳定性好，能够诱导细胞的增值和分化，并且可降解。因此被广泛应用与生物医学领域中，明胶分子链侧链上有许多氨基官能团，能够在晶体矿化过程中与钙离子有序结合，以FA片段为成核中心，球形的小晶体开始在片段的两端开始聚集生长，从而调控晶体矿化过程，随着反应时间的延长，钙离子不断释放，合成晶体从开始的成簇聚集变成六棱柱样结构，沿着晶体的c轴不断聚集，当钙离子的释放完全后晶体的矿化结束，最终在明胶的调控下生物模拟天然釉质的矿化过程，得到与天然釉质相近的FA晶体[16]。

XRD测试通常是用来分析晶体的化学结构的。实验组与标准的FA晶体结构 (JCPDS#15-0876)非常接近，特征峰值表明其组成部分为FA，因此，确定本实验获得的类釉质样晶体为FA。这也与扫描电镜形貌相符，说明在仿生条件下，形成形貌规则、结晶性较好的FA纳米晶体，较长的反应时间是必备条件之一。

FTIR是用来分析有机分子的构象及结构转变的情况，实验证明明胶分子链中含有很多化学键相互作用，有机物和无机物之间有化学键结合，有较强的分子力作用。

XPS是由材料内电子的跃迁产生特征光谱，它与原子序数一一对应的，因此是目前元素分析的主要检测技术[16]，实验显示构建的晶体主要是由Ca、P、F组成，与牙釉质组成部分相似，在明胶存在的条件下制备的FA的Ca/P更接近天然釉质，F离子占的比例高于天然釉质(3.8%)，因此其抗龋能力更强。

综上所述，通过结合XPS、XRD和FT-IR显示的数据，表明合成的样品主要为FA晶体。本文利用生物矿化原理，采用明胶基质作为有机大分子模板，仿生构建类釉质样FA晶体，并对其反应过程及形态相貌进行了调控，为人体硬组织缺损修复提供了理论依据，但对于其在牙釉质表面的生物矿化以及其生物相容性还有待于进一步研究。