DNA损伤修复基因Eme1在肿瘤发生及放化疗调控中作用的研究进展

邓于红，徐祖敏

(广东医科大学附属医院，广东湛江 524000)

DNA是生物遗传信息的主要载体，因此保持DNA的完整性和稳定性对细胞的延续及其发挥正常的生理功能具有非常重要的意义。基因组DNA面临各式各样的损伤，面对这些损伤机体如果不能及时正确地修复，可能导致基因组不稳定甚至肿瘤的发生。为了维持基因组的稳定性，生物在进化过程中逐步建立出一套完整而精密的损伤应答系统来监控和修复DNA损伤。DNA损伤的原因有内源性(例如细胞代谢过程产生的活性氧自由基)和外源性(包括电离辐射、化学药物等)[1,2]，根据损伤类型可分为DNA双链断裂和DNA单链断裂[3]。DNA损伤的后果短期可出现生理功能紊乱、异常增生和代谢、细胞死亡，长期效应则有肿瘤的发生、老化、疾病。双链断裂是DNA损伤的主要形式，其修复方式主要有同源重组和非同源末端连接修复[4]，两者可相互协调共同完成DNA双链断裂的修复[2,5]。真核生物中DNA双链断裂修复的主要通路是同源重组[6]，DNA损伤修复基因Eme1编码的蛋白质参与了DNA双链断裂的同源重组修复过程[7,8]。Eme1与Mus81可形成异二聚体蛋白质复合物，作为结构特异性核酸内切酶起作用，在DNA双链断裂修复及异常Holiday连接、复制叉结构、D-loops等的切除过程中发挥了重要作用。正常细胞具有复杂的DNA损伤修复反应途径,其激活可引起细胞周期停滞、细胞凋亡或者细胞衰老，还可抑制细胞癌变的发生，而肿瘤细胞中的DNA损伤修复反应的激活可能导致对放化疗不敏感。近年来研究发现，Eme1与多种恶性肿瘤的发生发展相关，且可能参与肿瘤放化疗敏感性的调控过程。现就Eme1在DNA损伤修复中的作用及其与肿瘤易感性、放化疗敏感性等的关系进行综述。

1 Eme1基因及其编码蛋白的结构

人类Eme1基因位于细胞核17号染色体长臂q21,33，序列总长度为20 kb，包含9个外显子，属于EME1/MMS4家族，编码的Eme1蛋白由583个氨基酸构成，相对分子质量为65 kDa[9]。其结构包括一个中心核酶活性区，C末端有两个重复的螺旋—发夹—螺旋(HhH)模序结构、一个螺旋接头和一个柔性结构域内接头组成，C末端区域对于Eme1的DNA修复功能是必需的，可识别DNA及与Mus81结合，辅因子为Mg2+[10]。Mus81蛋白通过其N端与细胞核固定，并利用其C端与Eme1蛋白结合形成异源二聚体。Mus81蛋白的结合蛋白在酿酒酵母中为Mms4，在粟酒裂殖酵母和哺乳动物中为Eme1[11]。Eme1/Mms4是Mus81发挥核酸内切酶活性的必要条件。Eme1与Mms4蛋白质只有少量的序列相似性，这主要局限于它们的C端包含一个假定存在的HhH模序结构和有缺陷的核酸酶结构域，而这个区域对与Mus81蛋白的结合是重要的，也有助于与DNA的结合[12]。Eme1蛋白在成人许多组织和胚胎发育的不同阶段普遍表达[13]。

2 Eme1的功能

2000年，Boddy等[14]在酵母菌中首次鉴定得到Mus81基因，并称之为“对乙烷磺酸盐及紫外线敏感的第81号独立序列”，发现Mus81在DNA重组修复中可识别、促进乙烷磺酸盐和紫外线引起的DNA损伤或参与损伤耐受过程。2001年，Boddy等[15]又在裂殖酵母中发现Eme1蛋白通过与Mus81蛋白的C末端相连，共同将DNA形成的Holliday交叉解离为线性双螺旋结构，并证明Eme1和Mus81是核Holliday交叉解离酶的亚基。在有丝分裂和减数分裂的重组过程中，以及DNA双链断裂时的同源重组途径中会出现由四条DNA单链构成的中间体，即Holliday交叉结构，这个结构的解螺旋对于染色体的精确分离起着重要作用。Mus81-Eme1复合物可以解螺旋带有切口的Holliday交叉结构，产生基因转换的修复产物。后续研究还发现，Mus81-Eme1复合物组成的异二聚体核酸内切酶，在分解一些DNA结构,如复制叉、3构游离末端中起作用，可促进DNA修复，保持基因组稳定性[12,13,16]。DNA复制过程中产生的复制叉在遇到一些自然程序障碍物或偶然发生障碍物时可受阻，如遇rDNA间隔区内的终止位点时可发生DNA复制叉的自然受阻，偶然发生障碍物有一系列DNA损伤剂、DNA二级结构、模板DNA内的拓扑应力和DNA-蛋白质复合物等，此外，复制叉还可因一些复制蛋白和复制底物耗尽而受阻。停滞的复制叉可以通过非同源重组或同源重组途径来修复[9]。同源重组在处理停滞、受阻和受损的复制叉中起重要作用，停滞的复制叉中间体可被核酸内切酶裂解形成双链断裂结构，继而通过同源重组途径修复，而Mus81-Eme1/Mms4则通过启动同源重组发挥裂解停滞或受阻复制叉的作用[17]。2003年，人类同源Eme1基因被克隆，并发现人体内Mus81-Eme1核酸内切酶对合成的复制叉和3′游离末端特异性更高，而对Holliday交叉的解离能力较低[9]。Holliday交叉裂解的效率可以通过引入特异的同源序列来增强[18]。真核生物细胞DNA受到损伤时一方面可诱导修复基因的转录，另一方面还可启动细胞周期检查点对DNA损伤作出应答反应，暂时阻断细胞周期的进程，防止受损DNA的继续复制，如果损伤无法修复，则可诱导细胞进入凋亡。Mus81-Eme1可通过多种检查点通路参与DNA双链断裂的修复。Mus81-Eme1缺失可通过ATM-Chk2通路激活细胞周期G2/M检查点，越过S期检查点的DNA双链断裂、G2期形成的双链断裂可激活细胞周期G2/M检查点。如果复制叉停滞未经处理而形成DNA双链断裂，则可经ATM依赖的通路激活细胞周期检查点[11]，表明Mus81-Eme1复合体在细胞周期检查点，以及DNA修复、重组和复制过程发挥作用[13]。有研究对处于分裂中期的细胞用秋水仙碱处理后发现，敲除一个等位基因的Eme1+/-细胞出现染色单体和染色体畸变如缺口、断裂的概率比野生型细胞大，证实了Eme1参与维持染色体稳定性[11]。染色体脆性位点是染色体上随机的断裂点，它的存在预示着染色体的不稳定性，肿瘤细胞的染色体重排和缺失常常发生在这些脆性部位，这些不稳定的染色体及其脆性位点像基因一样可以遗传，有些脆性位点也是致癌剂敏感点和癌基因同位点，在某些因素作用下，脆性位点的敏感性和不稳定性升高，致使染色体发生突变、重排、丢失和断裂等，从而导致细胞内重要基因(癌基因、抑癌基因、DNA修复基因)发生变异，最终导致细胞癌变和肿瘤发生。而Mus81-Eme1结构特异核酸内切酶在细胞有丝分裂早期可与基因脆性位点结合，促使脆性位点在染色体中期出现特征性缺口或断裂的细胞学特征，主动的使染色体及时分离来保持基因组的完整性[19]。

3 Eme1与肿瘤易感性

DNA修复分子在维持遗传稳定性方面是非常重要的，许多人类疾病是由基因决定的，与体细胞基因突变或遗传变异有关[20]。肿瘤是外因与内因相互作用导致的一类疾病，许多外界致病因素的致癌作用都是使基因发生突变累积致病，而突变主要发生在三类基因：癌基因、抑癌基因、DNA修复基因。这些基因原本在细胞中行使正常的生物学功能，然而因某些致病因素的作用，这些基因可发生突变、插入、扩增、缺失或甲基化状态的改变。机体能启动多种修复DNA损伤的途径在一定限度内克服不利作用，使机体免于产生疾病。近年来在对肿瘤的研究中发现，Eme1可能与肿瘤易感性有关。Eme1编码区基因变异导致氨基酸的改变，可能造成Eme1蛋白与DNA的异常结合或不能与Mus81相互作用，从而增加肿瘤的遗传易感性[10]。已有研究报道Eme1遗传变异与几种肿瘤的发生有关，目前认为,不同个体DNA修复能力有差异且是由遗传决定的,这种差异性可能是DNA修复通路中的某些核心基因的单核苷酸多态性与环境因素的综合作用引起的。我国有研究者采用病例—对照研究的方法验证了Eme1基因遗传变异与中国南方人群肺癌发病存在关联，该研究显示Eme1 Ile350Thr(T>C)位点变异在肺癌组与健康对照组中的分布差异有显著性，携带Ile/Thr基因型个体发生肺癌的危险性是Ile/Ile基因型携带者的1.44倍，携带Thr/Thr基因型个体发生肺癌的危险性是Ile/Ile基因型携带者的1.44倍，Ile350Thr Thr变异基因型(Ile/Thr和Thr/Thr)患肺癌的危险性显著上升，且肺癌的发病风险与Thr等位基因(allele)个数存在显著的剂量反应关系[21]。Chang等[22]在研究了10 177个非同义突变cSNP与人类多形性胶质母细胞瘤的关系后发现，Eme1 Ile350Thr的遗传变异很可能与多形性胶质母细胞瘤的发生有关联。后来又有研究者在2013年[23]通过748例乳腺癌患者和778例正常对照的病例对照研究发现，中国南方女性Eme1 Thr变异可增加患乳腺癌的风险和促进乳腺癌早发，并呈苏氨酸等位基因依赖的剂量反应方式，而Glu69Asp变异与乳腺癌发病风险无明显关联，并指出Ile350Thr位点位于第二个HhH模序结构，这是与DNA结合的核酸酶活性所必需的结构。Ile350Thr变异属于外显子剪接增强子(ESES)，该变异可能会影响Eme1选择性剪接造成DNA的异常转录。Eme1基因的一个重要作用是通过对Mus81与DNA底物的特异结合的影响来保持基因组的稳定性[10]，研究表明，假如Eme1缺失，Mus81亦失去剪切活性[24]。因此该多态位点很可能通过氨基酸的改变，改变蛋白质的空间构象，影响Eme1与Mus81和DNA底物的特异结合，从而使基因的功能受到影响，导致肿瘤易感性增强。虽然具体机制有待进一步探讨，但这些研究表明，Eme1基因Ile350Thr位点遗传变异可能作为肿瘤易感性及发病早期的遗传标记。Eme1单核苷酸多态性还可能与儿童脑肿瘤、白血病和其他肿瘤的发生有关[25]。

4 Eme1在肿瘤放化疗敏感性调控中的作用

放化疗是临床上肿瘤治疗的主要方案，其是利用放化疗诱导肿瘤细胞DNA损伤，DNA损伤后启动的信号通路会导致细胞死亡来杀死癌细胞。放化疗对肿瘤细胞DNA的损伤类型主要有：DNA链断裂、DNA碱基损伤、DNA交联等。然而，DNA损伤修复也是肿瘤治疗抵抗的一种机制。Eme1作为DNA损伤修复过程参与者之一，其功能的变化可能影响肿瘤细胞的放化疗敏感性。DNA分子损伤最早是从研究紫外线的效应开始的，早期在对酵母的研究中即发现，Eme1和Mms4基因突变可导致细胞对紫外线辐射和羟基脲敏感，而对电离辐射不敏感或轻度敏感[8,26]。2003年，Abraham等[13]为了研究Eme1在哺乳动物体内的生物学功能，应用基因敲除技术建立了Eme1基因缺失的小鼠模型：只敲除一个等位基因的Eme1+/-小鼠和两个等位基因都被敲除的Eme1-/-小鼠，发现Eme1-/-细胞和野生型ES细胞相比生存活力或生长速率无差异。由此提示，正如在粟酒裂殖酵母和酿酒酵母中所观察到的，哺乳动物Eme1对于胚胎干细胞的存活和生长不是必要的，且通过比较两个等位基因都被敲除的Eme1-/-和野生型胚胎干细胞对DNA损伤剂(电离辐射、紫外线照射、羟基脲、顺铂和丝裂霉素C)的敏感性发现，与野生型对照组相比，Eme1功能缺失的胚胎干细胞对丝裂霉素C和顺铂(致DNA链间交联药物)浓度增加的敏感性很高，而Eme1-/-胚胎干细胞则对电离辐射、紫外线照射、羟基脲治疗轻度敏感，因此推断出哺乳动物胚胎干细胞Eme1基因在丝裂霉素C和顺铂诱导的DNA损伤修复中必不可少，也一定程度地参与了电离辐射、紫外线照射和羟基脲治疗的DNA损伤修复。后来Hiyama等[11]在人类结肠癌细胞系HCT116中证实，人类细胞中Eme1对DNA交联剂引起的损伤也有抵抗作用，原因可能是DNA交联剂可造成复制叉停滞，而Mus81-Eme1结构选择性核酸内切酶能修复和重新启动停滞的复制叉从而出现对DNA交联剂的耐受。Tomoda等[27]在同样的细胞系中发现，Eme1也参与对顺铂敏感性的调控，再次证实了Eme1可修复DNA交联剂引起的损伤。Tomoda等检测了DNA交联剂损伤修复蛋白Eme1、Mus81、ERCC1和Rad51在结直肠癌、乳腺癌及肺癌等9种恶性肿瘤的18株细胞系中的表达水平，并分析了不同肿瘤细胞系对顺铂的敏感性，然后选择其中10株细胞系检测了顺铂治疗后的细胞存活数，发现顺铂敏感性与Eme1水平的相关性大于与RAD51、MUS81水平的相关性，且Eme1水平与细胞对顺铂的敏感性之间存在一个规律，即Eme1水平低的细胞对顺铂敏感性高，而Eme1水平高的细胞对顺铂敏感性低。已有研究表明，ERCC1和Rad51蛋白可作为顺铂耐药的标志物，而Mus81-Eme1核酸内切酶复合物在DNA交联剂损伤修复过程中是XPF-ERCC1复合物的上游分子[28]，提示通过Eme1表达水平来预测对顺铂的敏感性比ERCC1和Rad51准确性更高[27]。顺铂及其类似物是肿瘤治疗中常用的化疗药物，而多项研究结果表明Eme1参与了化疗敏感性的调控，因此以Eme1作为化疗敏感性的潜在标志物成为可能。Vigneron等[29]的研究发现西妥昔单抗可促进DNA损伤反应通路的激活，并可抑制DNA修复过程中Eme1的降解，从而增强DNA的损伤修复能力。因此，当使用西妥昔单抗作为抗肿瘤药物时应该考虑这个方面，并且表明Eme1可作为预测西妥昔单抗耐药的标志物。虽然Eme1调控化疗敏感性的具体机制尚不明确，而Eme1调控放疗敏感性国内外目前尚无相关研究，但抑制Eme1介导的DNA损伤修复能否提高放疗和DNA损伤化疗的疗效仍值得我们进一步探究，以及以Eme1为靶点研发逆转肿瘤放化疗耐受的新措施仍有希望。

DNA损伤修复对避免基因组的不稳定、肿瘤和细胞死亡的发生是至关重要的，决定细胞命运的不仅是损伤严重程度，其修复能力和修复机制亦十分重要。Eme1作为DNA损伤修复基因之一，又参与肿瘤放化疗敏感性的调控，其结构及功能的改变可能导致肿瘤的发生发展和放化疗敏感性的变化。因此，明确Eme1在肿瘤中的表达、变异特点和作用机制，及其是否直接影响以及如何影响肿瘤的发生、演进过程和放化疗疗效值得进一步研究，并有望为肿瘤的早期诊断和预后评估提供新的分子标志物，也可为肿瘤复发转移的防治及提高放化疗敏感性提供潜在的药物作用靶点。