Twist在宫颈癌细胞株Hela中的表达变化及其对细胞侵袭转移的影响

程凤凤，于静，张晓莹，房爱菊，金作伟

(1山东省立第三医院，济南 250031；2济南齐鲁医学检验所)

宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其发病率位居女性恶性肿瘤的首位，全世界每年大约有53万新发病例和27万死亡病例，且大约85%死亡病例发生在不发达国家或者发展中国家，其病死率是发达国家的18倍[1]。目前虽然宫颈癌手术以及放化疗技术取得了突破性的进展，但绝大多数中晚期患者仍然预后不良。宫颈癌分子的异质性改变是导致宫颈癌放化疗抵抗、迁移及进展的主要原因[2]。因此，进一步寻找宫颈癌发生发展的分子机制，对于提高中晚期宫颈癌患者生存率、提高生存质量意义重大。Twist即扭曲因子，具有高度保守的碱性螺旋—环—螺旋结构，是一种具有调控作用的转录因子，在肿瘤细胞增殖、凋亡以及侵袭转移中均具有重要的调控作用[3]。目前研究已经证实Twist参与多种肿瘤的形成，包括乳腺癌以及前列腺癌等[4,5]。研究发现，Twist在宫颈癌组织中高表达，且Twist高表达的患者预后不良[6]，但其在宫颈癌侵袭转移中的作用机制尚未阐明。2014年10月～2017年12月，本研究以宫颈癌癌细胞株Hela以及人宫颈永生化上皮细胞H8为研究对象，旨在观察Twist在宫颈癌细胞系侵袭转移中的作用，为开发宫颈癌新基因靶向治疗提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 DMEM高糖培养基、RPMI1640培养基、胎牛血清以及胰酶等购自美国Hyclone公司；由Invitrogen公司构建慢病毒载体；Twist抗体购自美国GeneTex公司；Rac1以及MMP-2抗体购自Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京碧云天生物技术公司；高速冷冻多用途离心机购自德国Eppendorf Centyifuge。

1.2 细胞来源、分组及培养 宫颈癌细胞株Hela以及人宫颈永生化上皮细胞H8细胞购自上海生命科学院细胞和生物化学研究所。Hela细胞生长于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中(加入100 U/mL青霉素以及50 U/mL链霉素)，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每天换液1次，融合度长至80%左右时用0.25%胰酶消化后接种至6孔板中。每孔加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基3 mL继续培养。

1.3 Twist慢病毒过表达或沉默载体转染Hela细胞 构建Twist基因过表达质粒以及敲减质粒，并将其与病毒包装质粒转入293T，48 h后收集病毒，0.22 μm的滤器过滤后浓缩病毒，-80 ℃保存。实验前保证细胞的良好生长状态，取8×104个处于对数生长期的Hela细胞，接种于6孔板中，接种3个孔，分别为对照组、过表达组、沉默组。感染前为细胞换新鲜基础培养基，以复感染指数(MOI)值20，加入感染培养基(基础培养基1 mL+5 mg/L Polybrene)和相应的病毒量(病毒量体积=MOI×细胞数目/病毒滴度，对照组1.8 μL,过表达组3.4 μL，沉默组4 μL)。24 h后，37 ℃、5% CO2培养12 h，更换新鲜基础培养基，72 h后荧光镜观察感染率。

1.4 细胞侵袭能力检测 采用boyden侵袭实验。用胰酶将上述过表达组、沉默组以及对照组对数生长期的Hela消化制成单细胞悬液。聚碳酸酯微孔膜(孔径8 μm)分布于运动小室和侵袭小室的上下室之间，侵袭小室滤膜上包被人工基底胶，将人工基底胶置于室温下，无血清的培养基水化2 h。小室的下室均加含10%胎牛血清的完全培养基作为趋化因子，上室加入细胞悬液(细胞数约1×105)。37 ℃、5% CO2饱和湿度下培养，12 h后，分别取出聚碳酸酯微孔膜，中性甲醛固定，苏木素染色。在200倍光镜下随机计数5个视野计数，取其均值代表细胞侵袭力。

1.5 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。用胰酶将上述过表达组、沉默组以及对照组的对数生长期的Hela消化制成单细胞悬液。将细胞均匀铺置6孔板中，每孔2×106个细胞，将其置于培养箱中，待细胞贴壁后约8 h，用10 μL的枪头沿直尺方向做两条划痕，PBS冲洗3次后，加入无血清培养基培养。于倒置显微镜下每24 h记录1次细胞迁移情况。

1.6 细胞中Twist、MMP-2、Rac1表达检测 采用Western blotting法。收集H8、Hela细胞及Twist对照组、过表达组、沉默组细胞，RIPA冰上液裂解细胞15 min后将其置于超声仪中继续裂解10 min后离心(12 000 g，4 ℃，15 min)；蛋白浓度用BCA分析试剂测定；配胶，上样50 μg/孔，跑胶，湿转法转膜，5% BSA封闭2 h，加一抗孵育过夜，TBST洗涤，二抗孵育2 h，TBST洗涤，化学发光底物检测；X光片曝光显影、定影显示阳性条带，GAPDH作为内参。Image J软件测量灰度值并进行统计学分析。

2 结果

2.1 各组细胞中Twist蛋白表达比较 H8、Hela细胞中Twist蛋白的相对表达量分别为1.67±0.31、6.87±2.17，两者比较P<0.05。转染Twist基因过表达载体后，对照组、过表达组、沉默组中Twist蛋白的相对表达量分别为3.97±0.48、8.23±0.74、0.48±0.23，过表达组、沉默组与对照组相比，P均<0.05。

2.2 各组细胞侵袭能力比较 对照组、过表达组、沉默组穿膜细胞数分别为(41.38±11.32)、(281.38±12.32)、(11.28±14.32)个，过表达组、沉默组与对照组相比，P均<0.05。

2.3 各组细胞迁移能力比较 对照组、过表达组、沉默组细胞划痕愈合比分别为(31.43±5.22)%、(64.27±9.43)%、(14.16±5.21)%，过表达组、沉默组与对照组相比，P均<0.05。

2.4 各组细胞Rac1、MMP-2蛋白表达比较 对照组Rac1、MMP-2相对表达量分别为1.76±2.35、1.07±2.13，过表达组分别为3.78±2.76、4.24±1.97，沉默组分别为0.46±1.43、0.37±1.53，过表达组、沉默组与对照组相比，P均<0.05。

3 讨论

宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，其早诊率低，复发及转移率高，预后较差。目前研究已经表明，基因突变是导致肿瘤发生发展的关键因素，寻找导致宫颈癌发生的特异性基因对于宫颈癌的诊断及治疗都有着重要意义。Twist基因在动物与人类的生长发育以及胚胎形成中起关键调控作用，可以诱导细胞移动以及组织塑性[13]。有研究发现Twist与肿瘤的发生关系密切。如Han等[14]发现在乳腺癌中，Twist的表达明显升高，且与复发转移呈正相关；此外，一方面Twist可以调控EMT促进骨肉瘤的增殖、侵袭以及转移[15]，另一方面Twist还可通过调控血管内皮生长因子促进肿瘤新生血管形成，进而促进肿瘤细胞的侵袭转移等[16]。由此推测Twist在宫颈癌中也有同样作用。因此，本研究以Hela细胞以及H8细胞为实验材料，检测Twist在宫颈癌细胞以及正常细胞株中的表达情况，结果发现Twist在Hela细胞中表达显著高于H8；继而采用慢病毒转染技术过表达和沉默Twist基因后转染细胞进一步研究Twist在宫颈癌细胞中发挥的作用，结果发现转染Twist慢病毒过表达载体后细胞中Twist表达明显升高，功能实验显示细胞的侵袭能力和迁移能力显著升高。上述结果提示高表达的Twist促进宫颈癌细胞侵袭转移，与李雪莲等[17]研究发现Twist高表达促进宫颈癌侵袭转移的结果一致，但其作用的具体机制尚不明确。

侵袭转移是肿瘤的主要恶性生物学行为，是导致大部分肿瘤治疗失败的主要原因。肿瘤TNM分期高低的一个主要指标是有无远处侵袭转移。大部分癌基因之所以在肿瘤进展中发挥着关键调控作用，其主要原因是其可以促使肿瘤早期转移，而肿瘤是否发生早期转移决定了患者的预后[18]。研究[19]发现，Twist可以调控Rac1进而调控细胞迁移。Rac1是细胞内重要的信号转导分子，可以调控肿瘤的恶性转化、侵袭转移以及肿瘤血管形成等[20]。目前有研究报道Rac1可以通过调控基质金属蛋白酶2(MMP-2)促进肿瘤细胞侵袭转移[21]。MMP-2主要作用是降解细胞外基质[22]。MMP-2编码基因位于16q21上，较其他MMP相比，MMP-2催化区含有半胱氨酸嵌入物，在与胶原蛋白以及弹力蛋白结合过程中发挥关键作用[23]。有研究[21]证实，MMP-2在肿瘤细胞的生长、侵袭转移、肿瘤血管形成以及免疫调节等过程中均起着重要作用。本研究通过转染Twist慢病毒过表达载体和Twist慢病毒沉默载体至Hela细胞中发现，敲减Twist后，细胞中Rac1和MMP-2的表达显著降低，过表达Twist后，Rac1与MMP-2的表达水平显著升高，表明Twist可能通过促进Rac1和MMp-2的表达促进宫颈癌细胞的侵袭转移。

综上所述，Twist在宫颈癌细胞株Hela中高表达，促进/抑制其表达可以显著增强/降低Hela的侵袭转移，机制可能是通过作用于侵袭转移相关蛋白Rac1、MMP-2的表达进而调控细胞的侵袭转移。本研究为治疗宫颈癌提供新的策略，Twist可能成为宫颈癌治疗的潜在靶点。