焦亡及其在心血管疾病中的作用研究进展

周志友，陈佩儿，郑杰，程宇，陈灿

(广东医科大学附属医院,广州534023)

近年研究发现，消化道皮肤素(GSDM)家族具有诱导细胞死亡与炎症的作用，特别是消化道皮肤素D(GSDMD)与细胞焦亡密切相关。炎症体是一种细胞质内形成的复合体，可激活Caspase-1再水解pro-IL-1β与pro-IL-18。此能诱导一种新的程序性死亡--焦亡。细胞焦亡是以细胞肿胀、细胞膜破裂、炎症因子释放为特征的死亡方式[1]。 GSDMD之所以成为焦亡的执行者，主要因为其被Caspases水解之后具有的打孔效应。一般情况下完整的GSDMs分子不会诱导细胞焦亡，但当其被切割为N段与C段时，由于N段不再受C段的限制，N段便能与胞内膜相互结合形成穿孔效应[2]。此外，有相关证据表明GSDME亦能诱导细胞焦亡，而GSDMs家族中的PJVK至今仍无证据表明其与孔膜形成有关[2]。近年研究发现，细胞焦亡在心血管疾病(动脉粥样硬化、心肌梗死与缺血再灌注、糖尿病心肌病、心力衰竭等)发生进展等方面起重要作用。现将焦亡及其在心血管疾病中的作用研究进展综述如下。

1 细胞焦亡的概念及分子机制

细胞焦亡是新近发现的一种程序性细胞死亡形式，由微生物感染和内源性损伤相关信号诱导,依赖炎性 Caspase-1/4/5/11介导，伴有大量促炎因子的释放，诱发级联放大的炎症反应[3]。

细胞焦亡的分子机制主要分为两种:依赖于Caspase-1的经典途径和依赖Caspase-4/5/11的非经典途径。炎症小体是一种由机体模式识别受体(PRRs)参与组成的蛋白复合物体，由PRRs与特定配体结合，再结合其他蛋白所构成。每个炎症小体由 1 个 Caspase 的激活域和募集域(CARD)和/或 1 个热蛋白结构域(PYD)组成。病原体入侵时，含有CARD结构域的炎症小体直接募集pro-Caspase-1，并使其自身水解，产生具有酶活性的Caspase-1，活化的Caspase-1水解IL-β与IL-18并以活性的形式释放至胞外，诱发细胞焦亡。不含 CARD 结构域的炎症小体，则通过含CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)募集pro-Caspase-1。非经典细胞焦亡通路则通过 Caspase-4/5/11直接识别并结合细菌脂多糖(LPS)而激活。活化的 Caspase-1/4/5/11将GSDMD蛋白切割为具有成孔活性的GSDMD-N末端，GSDMD-N与细胞内膜结合形成孔道，致使细胞溶胀与渗透性裂解，诱发细胞焦亡。

2 焦亡信号的感知与启动

生物体内识别受体由模式识别受体(PRRs)、病原菌相关分子模式(PAMPs)与危险相关分子模式(DAMPs)组成，不仅作为人类先天性免疫对抗微生物侵袭的第一道防线，而且还具有保守与特征性的结构位点，这使得其能识别自身与异己。当细胞识别PAMPs与DAMPs信号后，炎症小体开始形成[3]。炎性小体由NACHT、LRR和PYD结构域的蛋白、凋亡相关斑点样蛋白 (ASC)、pro-Caspase-1所组成的多蛋白复合物构成。接头蛋白ASC含有 CARD和 PYD 结构域，通过 CARD-CARD和PYD-PYD结合的方式，形成的双重接头蛋白分子将炎性小体和 pro-Caspase-1 以桥梁的方式连接起来，并水解前Caspase-1，生成具有催化活性的 Caspase-1，作用于 pro-IL-1β、pro-IL-18 与GSDMD，生成有活性的IL-1β、IL-18与具有成孔效应的GSDMD-N末端，诱导细胞焦亡[3]。

3 细胞焦亡的执行者

3.1 GSDMD GSDMD 在食管、胃与皮肤表达，在这些部位的表达模式表明宿主对病原菌的入侵具有防御作用。相关证据表明，GSDMD作为Caspases底物，被切割水解产生具有与细胞内膜结合的效应片段，并在细胞膜上形成孔洞，导致细胞焦亡。通过敲除或低表达GSDMD，研究者发现鼠骨髓来源的巨噬细胞在对其进行脂多糖处理后，相比野生型，其不形成由Caspase-11依赖的焦亡[4]。

进一步研究发现，GSDMD 能被Caspase-1/4/5/11水解切割成30 kD N-氨基酸效应片段与25 kD C-氨基酸抑制片段。当GSDMD水解后，产生的GSDMD-N会与细胞内膜的磷脂酰肌醇磷酸盐结合[5]。

GSDMD结合形成孔径后，不仅能诱导细胞肿胀与焦亡，并且在细胞未完全溶解前促进炎症因子释放。GSDMD诱导细胞焦亡的抗菌效应，是通过释放死亡细胞内的病原菌实现的。通过这种方式，能使病原菌被巨噬细胞与免疫细胞捕捉与消灭。深入研究发现，焦亡还能诱导细胞间通道的形成，使病原菌能在溶解的细胞内容物残留中被捕获，从而被体内的吞噬细胞捕获与清除[6]。

3.2 GSDMA 人类的基因组只能编码一个单独GSDMA，而鼠类则编码GSDMA1、GSDMA2、GSDMA3三个亚型。人GSDMA与鼠GSDMA3由两个自我抑制结构组成：N-氨基酸段受到C-氨基酸段抑制。与GSDMD的N端结构域类似，293T 细胞中如果过表达GSDMA 与 GSDMA3的N端结构，亦会在细胞膜上形成孔径，诱导类似细胞焦亡的特征[7]。肿瘤坏死因子诱导的角质细胞凋亡需鼠来源GSDMA3。肿瘤坏死因子能上调GSDMA3表达，这又会促进Caspase-3表达与细胞凋亡的产生。过表达胃上皮细胞系中的人来源的GSDMA3能诱导以Caspase-3、Caspase-7激活为特征的细胞凋亡。

3.3 GSDMB 人能编码GSDMB，而鼠则不能。GSDMB至少有四个剪切变异体，相对分子质量为35～50 kD。GSDMB的整个蛋白与N端片段均能结合细胞内膜，这种结合方式使其区别于GSDMs 其他家族[8]。此外，GSDMB这种结合细胞膜的方式表明GSDMB-C末端不能抑制GSDMB-N末端与细胞膜结合。尽管如此，对于HEK293T细胞而言，只有GSDMB-N端才能诱导细胞焦亡的产生[7]。

3.4 GSDMC 对于GSDMC人类只能编码一种蛋白，而鼠则有四个亚型。与GSDMs其他的家族类似，在293T细胞中，过表达GSDMC-N端亦会诱导细胞焦亡[7]。

3.5 GSDME 与GSDMD被Caspase-1水解不同，GSDME的水解需Caspase-3，而它是内源性与外源性凋亡中共同的靶点[9, 10]。内源性凋亡主要导致线粒体膜通透性改变，外源性凋亡则是凋亡小体聚集后激活Caspase-9。在267-270位点，Caspase-3水解GSDME生成的GSDME-N末端使细胞膜穿孔，诱导细胞焦亡[10]。进一步研究发现，对于HEK293T细胞系，敲除GSDME能增加氧化应激产物凋亡与坏死的产生。在GSDME缺陷的巨噬细胞中，Caspase-3激活凋亡相关因子受体与细胞色素C并导致细胞膜损伤，这表明GSDME表达并不影响细胞坏死。

近年来，研究发现化疗药物如拓扑替康、依托泊苷、顺氯氨铂，通过介导Caspase-3切割GSDME产生焦亡现象[9]。而将不表达GSDME的HeLa细胞系，进行转染表达GSDME后，在TNF-α刺激下，细胞发生焦亡[9]。GSDME可作为化学药物理疗的一个潜在作用靶点。

4 细胞焦亡在心血管疾病中的作用

4.1 细胞焦亡在动脉粥样硬化中的作用 动脉粥样硬化是一种慢性进行性疾病，其特征是在大动脉中出现异常的脂质沉积，斑块形成后导致管腔狭窄，随后斑块破裂，诱发心、脑、肾等重要器官栓塞的现象。近年来，越来越多的证据认为炎症是导致动脉粥样硬化的首要原因[11, 12]。动脉粥样硬化是一种与内皮功能障碍相关的炎症性疾病。焦亡导致内皮细胞的功能障碍是疾病进展的关键原因[13, 14]。褪黑素有非常强的抗炎作用，对动脉粥样化鼠的模型进行12周褪黑素灌胃处理能明显降低模型鼠颈动脉斑块的形成，这说明褪黑素减缓动脉粥样硬化小鼠动脉内皮细胞的焦亡是通过抑制机体的炎症起作用的[12]。此外，还有研究发现香烟中的尼古丁通过ROS-NLRP3信号通路诱导内皮与巨噬细胞的焦亡，亦是导致动脉粥样硬化病情加重的重要因素[15]。

4.2 细胞焦亡在急性心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤中的作用 对于急性心肌梗死的患者，当前最佳的治疗方案是进行急诊PCI，尽快恢复冠脉血供，以减少心肌细胞死亡[16]。越来越多的证据表明，缺血再灌注后，炎症体-Caspase轴在炎症诱导的细胞死亡中起重要作用。炎症体是一个复合体，其能将Pro-Caspase-1变成活化的Caspase-1。活化的Caspase-1不仅能将pro-IL-1β转化为成熟的IL-1β与IL-18，而且还可对GSDMD进行切割成具有成孔效应的GSDMD-N末端，诱导细胞焦亡[17]。此外，激活缺血再灌注保护酶(PISK)、PI3k-AKT信号通路对缺血再灌注有一定保护作用[18]。研究发现，对离体鼠的心脏进行缺血再灌注处理，用Caspase-1的抑制剂VX-765处理后，能降低缺血再灌注损伤，这主要与抑制Caspase-1 、IL-1β、IL-18、ACS、NLRP3、GSDM-N末端的表达与提高PISK表达有关[19]。进一步研究发现，对已经过P2Y12受体抑制剂处理的大鼠，进行左前降支结扎再灌注前，尾静脉注射Caspase-1的抑制剂VX-765后。结果不仅降低炎症与焦亡相关因子的表达，而且能减少鼠的梗死面积、降低左心室重构、提高左室功能[20]。此外，有研究表明阻断sirt1/NOX4/ROS与mToRC1信号通路,有助于减缓缺血再灌注诱导的焦亡产生[21, 22]。

4.3 细胞焦亡在糖尿病心肌病中的作用 糖尿病心肌病是糖尿病患者终末期常见的一种临床综合征。研究认为炎症-焦亡在此病的进展中起重要作用。鉴于高糖是诱导炎症体NLRP3必不可少的成分，NLRP3可能是导致糖尿病心肌病进展的一个重要原因之一[13]。对高糖诱导的二型糖尿病鼠模型进行沉默NLRP3实验，发现基因沉默鼠心肌炎症、纤维化、焦亡降低与心功能障碍得到一定改善[23]。此外，对高糖处理的H9C2细胞亦观察到类似结果。此外，氧化应激产物在炎症的激活中起关键作用。抑制ROS产物的聚集，不仅抑制NF-κB信号通路，而且还能降低前炎症因子的释放[23]。

4.4 细胞焦亡在心力衰竭中的作用 心肌梗死是导致心肌细胞死亡、心室重构、心力衰竭的主要原因。恢复冠脉的血供是挽救濒临死亡心肌的最佳途径，但再灌注有时却会加重心肌细胞损伤与死亡，称之为再灌注损伤。再灌注后引起的炎症反应，一方面有利于促进伤口愈合与瘢痕的形成，另一方面过度的炎症反应会导致心肌焦亡与心室的不良重构[24]。

综上所述，GSDM是一类具有成孔效应的家族蛋白，在导致细胞死亡中起重要作用。GSDMs家族中的五个蛋白，除去PJVK，当过表达时，其蛋白的N端均会诱导细胞焦亡。GSDME被Caspase-3水解，而部分证据表明GSDMB能被 Caspase-1/3/6/7切割，GSDME的生理作用在化疗药物引起的细胞毒性中得到证实。此外，炎症与焦亡在心血管疾病进展中发挥重要作用。