沉默AFP表达对肝癌细胞侵袭转移的影响及机制

苏纯洁，何前进，毛伟明，张喜华，岑红兵，张松柏

(1荆门市第一人民医院，湖北荆门448000；2黄冈市中心医院)

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率均居世界第一[1]。近年来尽管肝癌的诊断和治疗有了长足进步，但肝癌的预后并未得到明显改善，主要原因在于肝癌的肝内和肝外转移[2]。肝癌较易转移的原因和相关机制尚不清楚。我们前期研究显示血清甲胎蛋白(AFP)水平和肝癌的侵袭转移相关。血清AFP>400 μg/L的肝癌患者较易出现肿瘤侵犯和术后转移[3]。AFP是肝细胞合成并分泌到血液中的一种糖蛋白，被视为肝癌诊断的血清标志物，在肝癌的筛查、临床诊断、术后复发监测过程中发挥重要作用。近年来研究发现AFP同肝癌预后密切相关，具有复杂的生物学功能[4,5]。研究发现，AFP可影响肝癌细胞的增殖,抑制细胞凋亡[4,5]。AFP同肝癌侵袭转移的研究不多，相关机制尚不清楚。基质金属蛋白酶(MMPs)是最重要的一组蛋白酶，与肝癌的侵袭转移密切相关。2018年3～9月，我们探讨了沉默AFP表达对肝癌细胞侵袭转移的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肝癌细胞系Hep3B细胞由武汉同济医院肝脏外科董汉华副主任医师馈赠。兔抗人AFP单克隆抗体购于Cell signaling公司，鼠抗人β-actin单克隆抗体购自Santa Cruz公司。Transwell小室购于美国Corning公司。Matrigel购于美国BD公司。转染试剂脂质体Lipofectamine2000购于美国Life Technologies公司,DMEM、胎牛血清由Hyclone公司提供,PCR 引物购于Invitrogen公司。AFP干扰的慢病毒载体购自上海吉凯基因化学技术有限公司。

1.2 细胞分组及慢病毒转染 将处于对数生长期的Hep3B细胞随机分为Hep3B/shRNA-AFP组、Hep3B/shRNA-control组，消化后种于6孔板中，用含有5%的胎牛血清DMEM培养基培养，待生长至65%融合时，将AFP干扰的慢病毒载体和对照病毒载体，按照感染复数为30(感染复数=病毒活性单位数/细胞数)的比例滴加到细胞培养液中。感染16 h后，吸出含慢病毒颗粒的培养液，更换培养液，继续培养。培养5 d后的细胞用于后续实验。

1.3 AFP蛋白表达检测方法 采用Western blotting法。裂解并提取肿瘤组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，进行蛋白定量后在12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上以每孔20 μL蛋白上样，进行电泳后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用1∶1 000稀释的兔抗人AFP抗体，4 ℃孵育过夜，β-actin作为内参。第2天，分别用1∶3 000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗鼠的二抗进行孵育后，用化学发光法在暗室内进行曝光、显影和定影。

1.4 细胞侵袭能力检测 进行细胞划痕实验。分别将感染AFP干扰慢病毒和对照慢病毒载体的 Hep3B细胞按每孔2×105个细胞均匀接种在6孔板上，次日观察细胞完全贴壁后用10 μL的无菌枪头在细胞表面划一横线，PBS洗涤3次去除脱落细胞脆片，加入无血清DMEM培养基。放回37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，分别于0、8和24 h在显微镜下观察拍照，实验重复3次。Image J软件分析划痕细胞扩增速度，统计空白区域占原始划痕区域面积的百分比。

1.5 细胞侵袭能力检测 进行Transwell实验。使用具有孔径为8.0 μm的聚碳酸酯膜过滤器的Transwell小室评估肝癌细胞侵袭能力。Transwell小室用Matrigel 1∶100比例稀释预处理，37 ℃培养箱中放置2 h。之后，将小室放入24孔板中，细胞按1×105个/室的密度接种于上室中，上室液体总体积为200 μL。下室加入含10%胎牛血清DMEM培养基600 μL，每组设3个复孔。培养24 h后取出Transwell小室，PBS冲洗，多聚甲醛室温下固定20 min，结晶紫染液染色5 min，蒸馏水冲洗。显微镜下对侵袭至微孔膜下层的细胞计数。

1.6 沉默AFP前后Hep3B细胞中MMPs mRNA的表达检测 采用real-time PCR方法。RNA提取试剂TRIzol提取细胞总RNA，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。取相同量的 mRNA逆转录为cDNA，以基因引物加荧光染料复合物SYBR Green Mix(2×)进行定量PCR，每个反应做3个复孔。荧光定量 PCR扩增反应体系为：cDNA模板1.5 μL，10 μmol/L的正向和反向引物各1 μL，SYBR Green Mix 10 μL，ddH2O 6.5 μL，总反应体系为20 μL。每个样本设3个复孔。反应条件：94 ℃ 5 min，1个循环;然后94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃1 min，33个循环;最后72 ℃延伸10 min，1个循环。选用β-actin做为内参引物。MMP1正向引物5′-CTGCTTACGAATTTGCCGACAGA-3′，反向引物5′-GTTCTAGGGAAGCCAAAGGAGCTG-3′，扩增产物长度130 bp；MMP2正向引物5′-GTTCATTTGGCGGACTGTGACG-3′，反向引物5′-ATTCATTCCCTGCAAAGAACACAGC-3′，扩增产物长度146 bp；MMP3正向引物5′-GGACAAAGGATACAACAGGGACCA-3′，反向引物5′-GAACCGAGTCAGGTCTGTGAGTG-3′，扩增产物长度140 bp；MMP7正向引物5′-GATGGGCCAGGAAACACGC-3′，反向引物5′-CCTAGACTGCTACCATCCGTCCA-3′，扩增产物长度107 bp；MMP9正向引物5′-CACGACGTCTTCCAGTACCGAGA-3′，反向引物5′-CATAGGTCACGTAGCCCACTTGGT-3′，扩增产物长度115 bp；MMP10正向引物5′-TCTGTTCCTTCGGGATCTGAGATG-3′，反向引物5′-TGAAATTCAGGTTCAGGGTTCCAGT-3′，扩增产物长度146 bp；MMP11正向引物5′-ACCTGGACTATCGGGGATGA-3′，反向引物5′-GGCTGGCCATATAGGTGTTG-3′，扩增产物长度188 bp；MMP14正向引物5′-CAGAGAAGGCACACAAACGA-3′，反向引物5′-CACTGGTGAGACAGGCTTGA-3′，扩增产物长度172 bp；MMP15正向引物5′-GGCCGACATCATGGTACTCT-3′，反向引物5′-GAGGTTGTTTCCATGCAGGT-3′，扩增产物长度178 bp；MMP17正向引物5′-GGTGCGTGCACTCATGTACT-3′，反向引物5′-GAAGGGGTAGCCGTCGTTAT-3′，扩增产物长度136 bp；MMP21正向引物5′-TCAAAGGCAATGCATACTGG-3′，反向引物5′-CGAAGTCCTATGACCCTCCA-3′，扩增产物长度186 bp；MMP24正向引物5′-AGTTTGTGACCGTCCTCCAC-3′，反向引物5′-AGCCATCTCTGCCTCACCTA-3′，扩增产物长度112 bp；MMP25正向引物5′-TTAACTAGTCGCGGGGATTG-3′，反向引物5′-ACTGAGGCTGGACAGCAACT-3′，扩增产物长度172 bp；β-actin正向引物5′-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTGAC-3′，反向引物5′-GCTCGCTCCAACCGACTGC-3′，扩增产物长度 171 bp。

2 结果

2.1 Hep3B/shRNA-control、Hep3B/shRNA-AFP细胞中AFP mRNA和蛋白表达比较 real-time PCR结果显示，Hep3B/shRNA-AFP组细胞中AFP mRNA表达量为Hep3B/shRNA-control组的(0.12±0.02)倍。Western blotting检测结果和real-time PCR结果一致，显示Hep3B/shRNA-AFP组细胞中AFP蛋白表达低于Hep3B/shRNA-control组。shRNA-AFP的干扰效率符合下一步实验要求。

2.2 沉默AFP表达对肝癌细胞Hep3B细胞侵袭能力的影响 Hep3B/sh-AFP组24h后空白区域占原始划痕区域面积百分比为77.1%±1.5%，Hep3B/shRNA-control组为51.3%±1.5%，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 沉默AFP表达对肝癌细胞Hep3B转移能力的影响 Hep3B/sh-AFP组、Hep3B/shRNA-control组穿透滤膜的细胞数分别为(463±47)、(718±23)个/HP，与Hep3B/shRNA-control组相比，Hep3B/sh-AFP组穿透滤膜的细胞数减少(P<0.05)。

2.4 沉默AFP表达对肝癌细胞Hep3B中MMPs基因表达的影响 Hep3B/sh-AFP组、Hep3B/shRNA-control组MMP1相对表达量分别为1.04±0.09、0.92±0.39，MMP2相对表达量分别为0.83±0.72、0.98±0.86，MMP3相对表达量分别为0.95±0.41、0.94±0.17，MMP7相对表达量分别为0.97±0.39、0.98±0.38，MMP9相对表达量分别为0.84±0.16、1.01±0.13，MMP10相对表达量分别为0.99±0.09、1.01±0.10，MMP11相对表达量分别为0.24±0.29、1.00±0.88，MMP14相对表达量分别为0.98±0.10、0.99±0.10，MMP15相对表达量分别为0.84±0.43、0.98±0.08，MMP17相对表达量分别为0.63±0.23、1.02±0.26，MMP21相对表达量分别为5.44±0.72、1.23±0.46，MMP24相对表达量分别为0.98±0.41、0.97±0.25，MMP25相对表达量分别为0.32±0.21、1.00±0.07，两组MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表达差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

肝细胞癌占原发性肝癌的90%左右,其较易发生肝内和肝外转移。肝癌根治性切除是目前最有效的治疗手段，但研究发现即使接受根治性手术，50%的患者仍会在5年内出现转移[2]。我们前期研究结果显示患者血清中AFP水平和肝癌侵袭转移密切相关。AFP>400 μg/L的肝癌患者中,28.2%(31/110)的患者肿瘤组织侵犯了血管；在AFP≤400 μg/L的肝癌患者中,16.5%(44/266)的患者肿瘤组织侵犯了血管，两者间存在统计学差异。AFP>400 μg/L的肝癌患者中根治术后1、3、5年转移率分别为17.6%(12/68)、38.2%(26/68)、45.6%(31/68)； AFP≤400 μg/L的肝癌患者中根治术后1、3、5年转移率分别为7.6%(13/171)、23.4%(40/171)、31.6%(54/171)，两者间存在统计学差异[3]。上述结果表明AFP和肝癌的侵袭转移密切相关，此与文献报道一致[4,5]。

本研究先在细胞水平上观察了AFP对肝癌细胞侵袭能力和转移能力的影响，与体内结果一致。因MMPs是目前已知间质胶原蛋白惟一的基质降解酶，能降解除多糖外的细胞外基质所有成分，故我们检测了AFP对MMP基因家族的影响。本研究结果显示，AFP表达下调可引起Hep3B细胞中MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表达下调。

目前研究发现MMP家族成员已增加到26个，基因间具有较高同源性[6～11]。研究显示MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP16均在肝癌组织中高表达，其同肝癌的侵袭转移密切相关[6～12]。本研究结果显示AFP选择性地调控部分MMP基因表达，而对另一部分MMP基因如MMP1、MMP3、MMP7、MMP10、MMP14、MMP24表达无明显影响，原因有待进一步研究。有文献[12]报道AFP可通过上调MMP2和MMP9促进HLE细胞的侵袭和转移，与本研究结果一致。

本研究表明AFP是一个潜在有生物学功能的蛋白。AFP表达升高后可激活PI3K/AKT信号,进而诱导Ras基因和Src基因表达,最终引起肝细胞的恶性转化。AFP还可通过调控细胞内第二信使递质Ca2+和cAMP的浓度,使蛋白酶A活性上升，从而促进细胞内DNA等物质的合成[4,5]。

综上所述，沉默AFP表达可降低肝癌细胞的侵袭和转移能力，其机制可能与抑制MMP2、MMP9、MMP11、MMP15、MMP17和MMP25表达有关。