FOXO3a在肿瘤发生发展中作用的研究进展

李超，郑洪

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)

叉头转录蛋白O(FOXO)家族通过对转录过程的特异性激活参与调节细胞周期进程、能量代谢及肿瘤发生[1]。FOXO功能失调将导致细胞增殖失控和DNA损伤积累，从而产生致癌作用。FOXO3a是FOXO亚家族的成员，亦称为横纹肌肉瘤样1叉头框，最先在人胎盘中被鉴别出来。FOXO3a基因位于染色体6q21[2]，其通过调节靶基因的表达在多种细胞周期进程中发挥重要作用。FOXO3a的亚细胞定位对其活性和功能有重要影响。FOXO3a的磷酸化导致其从细胞核易位到细胞质中，在胞质中与14-3-3蛋白结合，进而阻止FOXO3a再入细胞核。现将FOXO3a结构、与翻译后修饰(PTM)的关系及其在肿瘤发生发展中的作用综述如下。

1 FOXO3a的结构

FOXO3a的相对分子质量约为71 kD，其包含5个结构域：高度保守的叉头翼状螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域(FKH)、两个核定位序列(NLS)、1个核输出序列、1个C-末端反式激活结构域(TAD)。FOXO家族成员中，以上区域均为高度保守。高度保守的FKH主要负责FOXO3a与DNA间的相互作用，亦介导其与雌激素受体α(ERα)[3]和p53[4]间的相互作用。FOXO3a从细胞质转移至细胞核需通过NLS结构域，该结构域亦介导FOXO3a从细胞核的释放。C-末端的TAD结构域对于FOXO3a靶基因的反式激活至关重要。

2 FOXO3a的翻译后修饰(PTM)

PTM是调节蛋白质功能的基本过程，其影响蛋白质的亚细胞定位、分子半衰期、DNA结合亲和力及与其他细胞蛋白质之间的相互作用。FOXO3a的活性可通过多种类型的PTM进行调节，包括磷酸化、乙酰化、泛素化和甲基化[5,6]。这些可逆的PTM改变FOXO3a的定位，影响其DNA结合亲和力，并在靶基因特定位点改变转录模式[7]。FOXO3a中的这些修饰通过酶和信号分子的各种组合连续发生。

调节FOXO3a活性及其靶基因的主要机制是通过控制FOXO3a的细胞核-质穿梭，该过程可通过一系列激酶的磷酸化来实现，如蛋白激酶B、细胞外信号调节激酶(ERK)、血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶(SGK)和I-κB激酶β亚型(IKKβ)的磷酸化促进FOXO3a的核输出[8]。然而，由多聚二磷酸腺苷(ADP)-核糖聚合酶1介导的FOXO3a的聚ADP-核糖基化修饰促进FOXO3a从细胞核中排出[9]。FOXO3a在细胞质滞留后被泛素化，然后被蛋白酶体降解。FOXO3a PTM的位点已明确，这些激酶的激活通常与核FOXO3a的丧失相关。然而，p38、哺乳动物不育系20样激酶1和腺苷酸激活蛋白激酶对FOXO3a的磷酸化促进其核输入并增加其转录活性[10]。核输入和输出的平衡对维持FOXO3a功能非常重要，该平衡丧失导致包括癌症在内的各种疾病的发生发展。

核FOXO3a的PTM通过改变DNA结合亲和力和启动子结合特异性来调节其转录活性。在细胞核中，FOXO3a被p300和CREB结合蛋白乙酰化，并被组蛋白去乙酰化酶Sirt1和组蛋白去乙酰化酶Sirt2去乙酰化。Sirt1介导的去乙酰化改变了FOXO3a的DNA结合亲和力，而Sirt2的去乙酰化增加了其DNA结合活性。共激活因子相关的精氨酸甲基转移酶1在细胞核中的活化必须依赖于FOXO3a甲基化[5]。研究发现，K270上FOXO3a的甲基化导致DNA结合能力丧失，并减轻FOXO3a介导的细胞凋亡。FOXO3a的许多PTM可彼此组合或竞争从而相互作用。由于FOXO3a在细胞凋亡、细胞增殖、DNA损伤和对抗氧化应激中起关键作用。因此FOXO3a失调与一系列恶性肿瘤高度相关[11～15]。在多数恶性肿瘤细胞中，FOXO3a失调与异常的PTM调控有关。

3 FOXO3a上游激酶失调

FOXO3a可被上游激酶磷酸化，如AKT、ERK、SGK、IKKβ和IKBKE。磷酸化的FOXO3a通过与14-3-3蛋白结合，从胞核中易位至胞质中，FOXO3a进一步泛素化，然后通过泛素/蛋白酶体依赖性方式降解[16]。这些激酶的失调经常在不同类型的癌症中发生，且通过促进FOXO核-质穿梭或泛素蛋白酶体依赖性激酶降解而促进肿瘤的发生发展。

IKK在染色质重塑、细胞周期进程和核因子κB信号通路中起重要作用，其参与各种疾病的进展。IKK不依赖于AKT直接与FOXO3a相互作用并使其磷酸化，导致FOXO3a降解。胞质FOXO3a水平与诸多类型肿瘤中IKKβ表达相关。IKK对FOXO3a的负性调控在促进肿瘤发生中起关键作用。RAS-ERK信号传导途径可被广泛的细胞外生长信号激活，这些信号在分化、增殖和肿瘤进展中起关键作用。

PI3K-AKT信号传导途径涉及细胞多种基本功能，如增殖、生长和存活。PI3K-AKT信号传导途径常被不同类型的细胞应激刺激或毒性损伤而失调。如上游激活剂对PI3K-AKT的激活或PI3K/AKT基因的扩增导致AKT途径不受控制的激活，导致肿瘤发生。AKT在白血病细胞中被一些蛋白激酶异常激活。融合蛋白激酶NPM-ALK在30%～50%的晚期间变性大细胞淋巴瘤患者中产生。

10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是一种具有双重蛋白磷酸酶活性的肿瘤抑制因子。PTEN通过PIP3的去磷酸化和下调PI3K活性负性调节PI3K-AKT途径。在诸多原发性肿瘤中观察到由于基因突变导致PTEN失活，如甲状腺、前列腺、子宫和乳腺的原发肿瘤，PTEN活性的突变或丧失导致AKT信号通路异常激活及肿瘤发生过程中FOXO3a的核输出。

4 FOXO3a功能失调

FOXO3a功能失调引起的致癌作用与多种机制有关，因其调控许多参与细胞凋亡的基因(Bim、Noxa、Puma、FasL、TRAIL)和增殖的基因(p21、p27、p130、Cyclin G2、GADD45)[17]。已有研究证明FOXO3a与miR-21基因的启动子区域结合并抑制其在人神经母细胞瘤细胞中的启动子活性。Fas配体是促凋亡因子，是miR-21的下游靶标。FOXO3a转录因子抑制miR-21，导致Fas配体上调，从而引发细胞凋亡。转录抑制因子MXI1-SRα是FOXO3a的直接靶标，其介导FOXO3a对MYC基因活性的抑制。这些结果表明FOXO3a失调通过直接调节其靶基因表达和影响其下游效应因子如MXI1-SRα而促进其致癌作用。

5 FOXO3a与癌症中的其他转录因子协同作用

FOXO3a通过下调与雌激素受体(ER)相关基因的表达来抑制癌细胞增殖。FOXO3a与ER-α和ER-β蛋白的直接相互作用引起17β-雌二醇依赖性ER基因转录活性的抑制。在ER阳性乳腺癌MCF-7细胞系中，FOXO3a过表达上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p21、p27和p57)表达，从而抑制MCF-7细胞的生长和存活。分子研究表明p53和FOXO3a间存在一些结构和功能上的相似性。p53和FOXO3a均调控细胞周期进程和DNA损伤修复，且均可通过乙酰化和磷酸化进行PTM，二者调节了一系列共同的基因。因此，这两种转录因子之间存在功能性串扰。p53促进SGK的表达，而SGK磷酸化后抑制FOXO3a的表达。另一方面，FOXO3a可减轻由p53介导的Sirt1表达所产生的抑制作用，从而使p53脱乙酰化。转录因子RUNX3是一种候选肿瘤抑制因子，介导胃上皮细胞的凋亡和生长抑制，并与FOXO3a相互作用形成复合物，激活Bim诱导的细胞凋亡[11]。FOXO3a还与叉头框转录因子的其他成员协同作用，如FOXO3a与乳腺癌细胞中的FOXM1相互作用，它们调节ERα基因的转录。FOXO3a与其他FOX成员之间存在相互监管机制。在胶质母细胞瘤细胞中，SMAD基因通过转化生长因子β激活并与FOXO3a形成复合物以诱导生长抑制基因如p21的表达，而FOXG1与FOXO3a-SMAD3复合物结合并阻断p21表达。在这种情况下，不同FOX蛋白之间的潜在相互作用可能在FOX蛋白对肿瘤发生的影响方面产生更多的并发症。总之，它们的相互作用为肿瘤有效治疗的不同信号传导途径提供了整合点。

6 FOXO3a作为癌症的生物标志物和治疗靶点

目前，鉴于肿瘤的生理和解剖学特征，很难观察到患者明显的早期症状，导致大量患者在晚期诊断。因此，临床实践中需要寻找用于癌症早期诊断和判断预后的有价值的生物标志物。FOXO3a最近已成为多种恶性肿瘤的诊断、预后和治疗的潜在生物标志物。如FOXO3a表达被鉴定为霍奇金淋巴瘤肿瘤起始细胞生物标志物[18]。研究表明，FOXO3a表达可作为多种癌症的预后生物标志物[19～23]。有趣的是，FOXO3a的过表达与三阴性乳腺癌[21]、肝细胞癌[22]、胶质母细胞瘤[19]和胃癌[23]患者的预后不良相关，而FOXO3a的低表达与胶质瘤和卵巢癌患者预后不良有关。磷酸化FOXO3a的表达亦被确定为卵巢癌和急性髓性白血病的预后生物标志物[24]。FOXO3a的核定位被证明是管腔样乳腺癌的预后生物标志物。此外，FOXO3a的亚细胞定位被确定为预测宫颈癌、乳腺癌和食道癌中化疗和放疗反应的生物标志物[25]。虽然FOXO3a作为生物标志物的潜在价值已在小规模研究中确立，但很难在大量癌症患者群体中对其进行验证。因此，需对患者群体进一步大规模研究，以证实FOXO3a作为癌症生物标志物的效用。

由于FOXO3a在肿瘤发生过程中作用显著，其已成为化疗药物的潜在靶点。临床和实验室已测试了许多靶向作用于FOXO3a的药物。FOXO3a是急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中BMS-345541(高选择性IKK抑制剂)的间接靶点，其中p21的表达通过BMS-345541处理后FOXO3a的核转位增加而上调。该过程与AKT和ERK信号无关，这表明FOXO3a抑癌功能的丧失可能主要是由于IKK的过度活化[26]。在BCR-ABL阳性慢性粒细胞白血病细胞系中，STI571(伊马替尼)是BCR-ABL的抑制剂，通过触发FOXO3a依赖性细胞周期停滞和Bim表达来增加FOXO3a介导的细胞凋亡。儿茶素是绿茶的主要成分，可通过靶向作用于胰腺癌[27]和乳腺癌细胞中的FOXO3a进而诱导细胞凋亡。FOXO3a是许多抗癌药物的间接靶标，包括紫杉醇、顺铂、伊马替尼和力达霉素在乳腺癌细胞中的作用。所有这些化合物通过降低AKT活性来激活FOXO3a。然而，紫杉醇还增强了JNK活性，其靶向作用于FOXO3a和14-3-3蛋白。JNK通过磷酸化调节FOXO3a的活性或稳定性，并且减少其与14-3-3蛋白的相互作用，导致FOXO3a的核输出。

PI3K-AKT途径是表皮生长因子受体(EGFR)的主要下游信号传导途径，EGFR是参与癌细胞增殖的关键细胞表面受体。因此，化疗药物(曲妥珠单抗、拉帕替尼、阿法替尼、西妥昔单抗、吉非替尼和奈拉替尼)对EGFR的抑制导致PI3K-AKT抑制而增加FOXO3a的活性，这为乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌和头颈部肿瘤提供了一种新的有价值的治疗方案[28]。BNIP3L是促凋亡基因，是癌细胞化学增敏所必需的。该基因是FOXO3a的靶标之一。在乳腺癌细胞系中，抗体或小分子抑制剂对EGFR的阻断诱导FOXO3a的核转位并促进BNIP3L基因的表达，从而导致乳腺癌细胞的凋亡。FOXO3a的敲低也促进了结直肠癌对西妥昔单抗治疗的反应[29]。这些发现表明FOXO3a可能是小分子EGFR抑制剂的关键靶点，其活性也增加了癌细胞对拉帕替尼等药物的化学敏感性。与此一致，其他抗癌剂对FOXO3a的活化也使癌细胞对细胞凋亡具有抗性。然而，对于某些类型的癌症，FOXO3a靶向治疗效果存在差异。IGFR1和PI3KCA已被鉴定为结肠癌细胞系中FOXO3a的靶基因，此表明FOXO3a可通过多种机制激活PI3K-AKT信号通路，并可能有助于结肠癌的耐药性。然而，多数研究表明，FOXO3a的激活与肿瘤细胞中的凋亡途径高度相关。

FOXO3a通过直接诱导或介导与细胞增殖、生长和存活相关基因的表达而调节多种病理生理过程。FOXO3a信号传导的失调促进肿瘤的发生发展。目前研究表明，与肿瘤组织相比，FOXO3a靶向化疗在正常组织中具有较低的毒性。在化疗耐药的乳腺癌细胞系中，FOXO3a活化使细胞对化学治疗剂敏感是至关重要的。ERα是乳腺癌发展的关键调节因子，是内分泌治疗的有效靶点。ERα表达被认为是预后良好的标志物，功能性ERα水平在乳腺癌成功内分泌治疗中起关键作用。有充分证据表明，FOXO3a和FOXM1调节ERα的表达。因此，FOXO3a可能是决定内分泌治疗敏感性和耐药性的关键因素。PI3K-AKT信号传导途径是相对稳定的信号传导途径，其在癌症中通常不发生突变。因此，通过靶向PI3K-AKT途径的下游节点，鉴定FOXO3a的新型抑制剂用于未来的抗癌药物设计是有前景的策略。由于FOXO3a需为其活性或其失活募集共激活剂或抑制剂，故FOXO3a的共激活因子或辅阻遏物的靶向治疗是调控FOXO3a功能的一种方式。鉴于FOXO3a通路存在复杂的调控及存在与其他转录因子之间的相互作用，需进一步研究FOXO3a在肿瘤发生中的影响，以开发基于FOXO3a的有效治疗手段，使FOXO3a的临床应用有望在未来限制人类癌症的进展。