糖蛋白组学技术在肾脏疾病的应用

杨 旭 综述 刘欣颖 审校

蛋白质糖基化是重要的翻译后修饰，人体有超过一半的蛋白质需要糖基化修饰[1]，影响蛋白质的折叠、转运，并且调控大部分细胞外活动，包括细胞-细胞间或者细胞与基质之间的相互作用。因此，蛋白质糖基化在生命活动过程中起重要调控作用。

糖蛋白是与寡糖链共价连接的蛋白质。糖蛋白组学是大规模分离富集鉴定糖蛋白一门学科。根据蛋白质结合糖链不同，糖基化主要分为四种类型，分别是N-糖基化、O-糖基化、GPI锚定糖基化和C-糖基化。N-糖基化和O-糖基化最为常见。N-糖基化是指多肽链中的天冬酰胺(Asn)侧链氨基酸残基与N-糖链的N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)连接，而O-糖基化是多肽链通过N-乙酰半乳糖(N-acetylgalactosamine,GalNAc)与蛋白质上的丝氨酸(Ser)或者苏氨酸(Thr)侧链羟基连接(图1)。异常的糖基化过程与肾脏疾病的发生、发展有直接关联，因此该技术将为肾脏疾病的研究提供新的技术平台。目前学界对糖蛋白组检测技术的优缺点及其在临床应用中认识不足，故本文对此进行综述。

图1 哺乳动物细胞中N-糖基化N-连接糖蛋白是多肽在内质网和高尔基体中的加工修饰，最后形成复杂的天线结构。O-糖基化则是在乙酰氨基转移酶(OGT)和β-N-乙酰氨基己糖苷酶(OGA)作用下直接修饰蛋白分子；LLO：脂质连接低聚糖；OST：寡糖基转移酶；GIsI：α-葡萄糖苷酶I；GIsIIα/β：α-葡萄糖苷酶IIα-β异二聚体；Bip:重链结合蛋白；Asn:天冬酰胺；Ser:丝氨酸；Thr:苏氨酸

糖肽/糖蛋白富集的方法

生物样品成分包括糖蛋白和非糖蛋白，低丰度和高丰度等。如何运用质谱技术对这些生物样品进行检测是糖蛋白质组学研究中首要问题，所以在进行质谱分析之前，首先需要对低丰度糖肽进行分离和富集。目前报道的分离富集的方法包括：凝集素亲和法、亲水相互作用色谱法、肼化学富集法和硼酸法等。

凝集素亲和法凝集素是一类能高度专一识别糖并与之高亲和力可逆结合的蛋白质。凝集素亲和法主要用于选择性捕获特定糖型，例如含有唾液酸和盐藻糖的聚糖。因此基于凝集素的糖蛋白组学研究对象主要是含有盐藻糖基化和唾液酸糖基化的糖蛋白。Waniwan等[2]将凝集素-磁性纳米探针和HCD-CID-MS/MS耦合，成功揭示耐药性非小细胞肺癌细胞中具有更多的盐藻糖基化和唾液酸化糖肽。虽然凝集素亲和法操作简单，但是凝集素对糖链结构识别具有选择性，所以难以对整个糖链结构进行全面精确地分析。

亲水相互作用色谱法亲水相互作用色谱法的机制是依靠糖链亲水性的差异。亲水性聚糖会吸附在形成稳定富水层的极性材料表面，而亲水性较低的肽段和盐则保留在本体溶剂中被洗脱。一些亲水性的材料如纤维素已经被用来选择性的富集N-连接聚糖。该方法操作简单，不破坏糖型，可以富集各种类型的糖肽，但是由于这是一种非特异性的吸附，不能够将亲水性非糖肽和糖肽完全区分开来，因此富集特异性并不理想。

肼化学富集法肼化学富集法首先由Zhang等[3]应用于人血清蛋白和血浆膜蛋白的蛋白质组学分析。先利用高碘酸将聚乙二醇氧化产生醛基,再将醛基与载体上的肼化学基团反应生成肼腙共价键，然后通过清洗去除非特异性吸附的糖肽。N-糖肽酶F(PNGaseF)会切割捕获N-连接糖蛋白上天冬酰胺残基和GlcNAc之间的糖苷键，然后通过质谱分析技术鉴定去糖基化糖肽。与亲水相互作用色谱法相比，该方法特异性高，但是强氧化剂高碘酸除了氧化糖蛋白的聚乙二醇，也会氧化肽段上的其他基团产生副反应。

硼酸法硼酸法是利用硼酸基团在碱性条件下可被羟基化，在酸性条件下反应可逆向进行的原理。硼酸法用于糖肽/糖蛋白富集具有高度特异性，但是当利用硼酸法将糖肽从含有大量非糖肽的复杂样品中分离出来时，可能会存在非糖肽物质抑制糖肽结合的现象。而且如果样品中的非糖类物质具有和糖肽相同的化学结构，同样会发生反应被捕获[4]。Xiao等[5]通过硼酸法对酵母细胞和人体细胞中的糖蛋白进行分析，成功在酵母中鉴定出234种O-连接糖蛋白，同时在人体细胞中也鉴定了1 127个蛋白上的2 710个N-糖基化位点。总之，该方法简单快速，具有高度可重复性，而且可保持糖肽的完整，有利于鉴定糖基化位点和分析聚糖结构。

其他方法近年来也有文献报道另外两种非常有效的糖肽/糖蛋白富集和分析方法。Woo等[6]首先提出利用同位素靶向糖蛋白质组学方法结合代谢标记和同位素来分析糖蛋白。探针标记的糖肽会在质谱中呈现出独特的同位素模式。Sun等[7]结合化学和酶促反应，运用NGAG(N-linked glycans and glycosite-containing peptides)方法靶向标记N-糖肽，成功在哺乳动物细胞中鉴定出2 044种特异N-糖肽。NGAG还可定量检测总蛋白和位点特异性聚糖中的糖蛋白的改变。

以上证据提示，四种主要的糖蛋白富集技术具有各自的优缺点。凝集素亲和法和亲水相互作用色谱法对糖链识别的特异性不高，但是操作简单；肼化学富集法对糖肽富集具有高度特异性，但是可能会产生副反应；而硼酸法也显示出了巨大的应用前景。因此，选取恰当的糖蛋白富集方法是后续利用质谱分析技术鉴定糖蛋白位点、解析糖链结构的关键。

糖蛋白组学技术与肿瘤相关疾病

大量研究显示异常的糖基化过程与肿瘤的转归密切相关。甲胎蛋白(AFP),前列腺特异抗原(PSA)，癌胚抗原(CEA)等糖蛋白已成为疾病筛查的常规指标，也是评估预后的重要依据。AFP是一种分子量为70 kD的N-连接糖蛋白，大部分是由胚胎时期的肝脏和卵黄囊产生，小部分由胃肠道生成。血清中的AFP浓度在胚胎的第12周至第十六周达峰，随后迅速下降，直至胎儿生后2周血清中只能检测到微量AFP。正常人血清中AFP的水平应<20 ng/ml。如果发现血清AFP>400 ng/ml且持续一个月，应高度怀疑肝细胞癌可能。PSA是由前列腺腺泡和导管相连的上皮细胞分泌的N-连接糖蛋白。PSA产生之后主要存在于精液和前列腺中，血清中的PSA水平极低，当前列腺结构破坏，PSA释放入血循环导致血清中PSA的水平异常升高。此时应考虑前列腺恶性肿瘤可能。CEA是分子量为180 kD的糖蛋白，在成年人血清中含量低于2.5 ng/ml。CEA除了作为结、直肠癌的监测指标，在胰腺癌和胃癌等其他胃肠道恶性肿瘤中也具有较低的特异性。糖蛋白组学技术已经较多地运用于癌症的诊断治疗和预后评估中，寻找癌症相关的特异性糖基化位点一直是癌症研究的热点。

糖蛋白与肾脏疾病

IgA肾病(IgAN)IgAN是一种常见的慢性原发性肾小球疾病，预后较差，只有不到10%的患者能够完全缓解，6%～43%的患者会在初次诊断后10～20年进展为终末期肾病[8]。人类血清中的IgA主要是以单体形式存在，分为IgA1和IgA2两种完全不同的亚型，其中IgA1约占90%[9]。IgA1与IgA2相比在重链上多一个独特的铰链区，该区具有多个丝氨酸或者苏氨酸残基，与GalNAc连接形成O-连接聚糖，然后分别在核心β1，3-半乳糖基转移酶(C1GalT1)和唾液酸转移酶的作用下，将半乳糖(galactose,Gal)以β1，3键先与GalNAC结合生成Galβ1，3GalNAc,再以α-2,6键与GalNAC结合或者以α-2,3键与Gal结合形成更长的糖链。若IgA1的GalNAC未与Gal连接则称为半乳糖缺陷(Gal-deficient)。IgAN患者的一部分IgA1分子铰链区O-聚糖就存在半乳糖缺陷，而且与正常IgA1相比，其IgA1铰链区GalNAc的糖型分布更多[10]。这些变化会导致患者体内产生末端带有GalNAc的特异性抗原，再与机体内针对半乳糖缺陷型的IgA1自身抗体结合形成免疫复合物沉积在肾小球中引起肾脏损伤[11]。Serino等[12]为了更好的了解IgAN中簇状O-糖基化的过程以及起始酶在该过程中的作用，研究了GalNAc-T2对IgA1铰链区的糖基化作用，证明了糖基化途径多样性和糖基化密度之间的相关性。因此，糖蛋白组学研究可帮助我们在糖蛋白层面上更深入了解IgAN的发病机制，甚至寻找出疾病相关的特异性生物标志物。

糖尿病肾病(DN)DN是糖尿病常见的微血管并发症之一，20%的糖尿病患者都合并DN[13-14]。肾脏是人体的排泄器官，附着在肾小球基底部的足细胞是血液滤过屏障的组成结构，在阻止大分子物质流失到尿液中的同时也参与调节水的重吸收过程。大部分参与这些过程的细胞内和细胞表面蛋白都会与天冬酰胺结合发生N-糖基化。已有研究表明在DN早期，细胞表面和细胞外基质N-连接糖蛋白已经发生形态上的变化[15]，但是对该种变化发生的机制和这些形态上的变化是否会引起糖蛋白丰度的变化尚知之甚少。Ravid等[16]利用凝集素亲和层析法证明了二肽基肽酶4(DPP4)的异常糖基化与DN之间存在着实质性的联系。人源性DPP4是一种以二聚体形式存在的跨膜糖蛋白，广泛分布在肝、肾、肠、脾等人体器官当中。该作者还发现在疾病早期，链脲佐菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠和对照动物之间DPP4表达存在着显著差异，但是在疾病的后期却并没有观察到明显的差异。他们应用免疫沉淀法和凝集素法分析发现DPP4出现了异常的糖基化状态。Bermingham等[17]发现1型糖尿病患者的血糖控制水平与血清当中IgGN-聚糖的显著变化有关,但是并不能阐释N-聚糖的异常糖基化与DN的因果关系。亮氨酸的α-2-糖蛋白1(LRG1)最近被发现与DN预后相关[18]。敲除LRG1显著减少糖尿病引起的肾小球血管生成和足细胞丢失，延缓了糖尿病性肾小球病的发展，但是具体LRG1的糖基化过程是如何影响DN的预后仍待进一步的探索。以上研究都表明DN存在着异常的糖基化，但是并不能定量测定这些异常的糖蛋白，也不能确定异常的糖基化位点。因此，确定异常糖基化具体位点和特异性疾病标志物是目前研究的重要方向。

常染色体显性多囊肾病(ADPKD)ADPKD是最常见的常染色体显性遗传病，约占发达国家终末期肾病患者的5%～10%[19]。80%～85%的病例都存在16号染色体PKD1或者4号染色体上的PKD2突变。PKD1和PKD2分别编码多囊蛋白1(polycystin-1)和polycystic-2,这两种多囊蛋白的缺失会导致正常的肾脏结构被无数小囊代替并逐渐导致肾衰竭。α3β1整合素受体是一种介导细胞外基质和细胞-细胞相互作用的异二聚体跨膜蛋白[20]。Zhang等[21]选取α3整联蛋白的轻链部分，在小鼠模型中运用基于液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法分析了从Pkd1-/-细胞和Pkd1+/+细胞内分离出的α3整合素亚基上异常和正常的N-连接糖基化结构。他们发现与Pkd1-/-细胞相比，Pkd1+/+细胞在Asn-925和Asn-928这两个糖基化位点上有相对分子质量更高的聚糖结构。而且也在Pkd1-/-细胞上观察到了独特的二唾液酸聚糖结构。多囊蛋白2是瞬时受体电位(TRP)通道超家族的成员，被归类为瞬时受体电位通道多囊蛋白2(TRPP2)。在ADPKD患者中发现受体电位通道TRPP2被严重N-糖基化。Hofherr等[22]全面分析并确定了人类TRPP2中的五个异常的天冬酰胺糖基化位点：299、305、328、362和375，这些异常的糖基化会影响真核细胞中分泌蛋白和膜蛋白的稳态，从而导致APDKD的发生。这些研究结果都表明异常的蛋白质糖基化可能在ADPKD发病机制中发挥作用。同样ADPKD特异性糖基化位点仍不确定，有待于进一步的研究和探索。

除上述肾脏疾病，糖蛋白组学技术在其他肾脏疾病中也有很多其他应用。比如在肾细胞癌(RCC)中Zhang等[23]基于3-氨基苯基硼酸和唾液酸之间相互作用开发新型阻抗式生物传感器用于诊断肾细胞癌。唾液酸是黏蛋白、糖蛋白和糖脂中寡糖链的组成成分。而转移性癌细胞通常表达高丰度富含唾液酸的糖蛋白。唾液酸的量会随着肿瘤的恶化而急剧增加。硼酸盐化合物3-氨基苯基硼酸(APBA)分子对唾液酸的结合力非常强，细胞传感器灵敏度大大提高。这是一种新型、简便且无创的肾细胞癌检测手段。总之，糖蛋白组学技术在肾脏疾病中显示出了巨大的应用前景。

小结:(1)蛋白质糖基化在生理与疾病过程中起重要的调控作用；(2)低丰度的糖蛋白和复杂的聚糖结构是糖蛋白组学精准检测的难题；(3)凝集素亲和法、亲水相互作用色谱法、肼化学富集法、硼酸法糖蛋白分离富集技术各有优缺点，选取恰当的糖蛋白富集方法是后续利用质谱分析技术鉴定糖蛋白位点、解析糖链结构的关键；(4)糖蛋白组学检测技术在肾脏疾病中的应用，不仅将成为肾脏疾病的重要诊断手段，而且必将对肾脏病疾病发生、发展和机理研究起到重要地推动作用。