MicroRNA在甲状腺功能减退症中的作用＊

赵 静，柏力萄，李 菲，王丹玮，吴芳莹，董广通，魏军平

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

甲状腺功能减退症（hypothyroidism，简称甲减）是由于甲状腺激素合成和分泌减少或组织作用减弱导致的全身代谢减低综合征，主要分为临床甲减（overt hypothyroidism）和 亚 临 床 甲 减（subclinical hypothyroidism，SCH，简称亚甲减）。甲减是患病率仅次于甲状腺结节的第二大类甲状腺疾病，我国患病率为17.8%，其中临床甲减与亚甲减的患病率分别为1.1%和16.7%[1,2]，但目前甲减分型繁多，病因较为复杂，相应病理机制在很大程度上仍未得到阐明。近年来，miRNA的发展为多种疾病的阐释提供了崭新的视角。越来越多研究表明，如miRNA与甲状腺的生理功能，甲减的病因、病理、诊断、治疗等方面均具有一定联系。多种miRNA在甲状腺功能减退症中存在差异表达，并可能参与相应的病理进程。现就miRNA在甲状腺功能减退症中的研究及应用进展进行综述。

1 miRNA概述

微小RNA(microRNA miRNA)是一组内源性、功能性的非编码小RNA，长度约18-24个核苷酸，可在转录后水平调控基因表达，影响下游蛋白的翻译，进而参与细胞增殖、分化、凋亡、机体应激、免疫、生长和发育等多种生物学过程，并发挥重要调控作用[3]。miRNA可调控人类近1/3的信使RNA（messenger RNA，mRNA），而miRNA的表达改变可能导致多种病理状态和临床疾病包括肿瘤、神经系统疾病、自身免疫性疾病等的发生发展。

成熟miRNA形成的经典过程一般包括如下步骤：第一步，miRNA基因主要被RNA聚合酶II（RNA polymerase II，POLⅡ）转录成长度为几百到几千个核苷酸且具有典型发夹结构的miRNA初级前体primiRNA。第二步，pri-miRNA在双链的RNA核酸内切酶RNaseⅢ-Drosha、双链RNA结合蛋白迪乔治综合征危象区基因 8（Di George syndrome critical region8，DGCR8）作用下，被加工为大小约70个核苷酸并可形成茎-环结构的miRNA前体，即pre-miRNA，这一次剪切发生在细胞核内。第三步，pre-miRNA通过输出蛋白5（exportin 5,XPO 5）从核内转运到细胞质中，并被Dicer内切酶剪切加工为不完全配对的双链RNA双体miRNA/miRNA*，其中miRNA与RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC)结合，形成微小RNA基因沉默复合物（miRISC），miRISC可与特定靶mRNA 的 3′-非编码区（3′-UTR）结合，从而降解mRNA或阻遏其翻译，进而影响基因的转录后表达，而关键miRNA生物发生因子的遗传改变可导致疾病[4,5]。

目前研究表明，miRNA与甲状腺的生理功能，甲减的病因、发病机理、诊断、治疗等均有一定关系，因此，深入了解miRNA在发育和疾病中的作用，有助于探明甲减的发病机制，并有望为未来针对甲减的miRNA靶向药物如miRNA抑制剂的开发提供部分思路。

2 miRNA在甲状腺生理功能中的作用

2.1 miRNA与甲状腺发育

miRNA是一类小的非编码RNA，在转录后水平调节基因表达，在机体的生长发育中发挥重要调控作用。Dicer酶作为miRNA成熟过程中的关键酶之一，对于阐明miRNA功能意义重大。迄今为止，已经在几种条件性Dicer敲除的小鼠模型中证明了miRNA对于正常器官发生的重要性，相关研究证实其在甲状腺的发育过程中也起到关键作用。一方面，miRNA通过调整甲状腺特异性基因的表达，维持甲状腺组织自稳态。Rodriguez W等[6]发现Dicer突变小鼠可以发生严重甲状腺功能减退并在断奶后迅速死亡，并在Dicer突变小鼠甲状腺中观察到明显的甲状腺滤泡破坏以及钠碘转运体（Sodium/iodine symporter,NIS）表达的明显下调，证实由于Dicer失活导致的miRNA成熟异常可严重干扰功能性甲状腺分化。Undeutsch H等[7]设计了甲状腺细胞特异性Dicer1基因敲除小鼠，发现甲状腺细胞中Dicer1缺陷与甲状旁腺纤维化，脂肪形成和Tgf-β信号传导基因的增强表达均有关系。从而证实Dicer1是甲状腺滤泡组织，甲状腺细胞分化和甲状腺肿大发展所必需的。Frezzetti D等[8]认为甲状腺的发育和早期分化不受Dicer缺乏的影响，而严重的甲状腺功能减退症在出生后逐渐发展，导致体重减轻和寿命缩短。因此，完整的miRNA加工机制对于甲状腺生理学至关重要，特定miRNA的失调也可能与人类甲状腺功能障碍有关。另一方面，DGCR8蛋白是miRNA生物发生机制的重要组成部分，其缺失也导致严重的甲状腺功能减退，动物体重迅速下降最终导致肾衰竭和动物死亡，进一步证实miRNA在甲状腺器官稳态中所发挥的重要功能[9]。

2.2 miRNA与甲状腺激素（Thyroid hormone,TH）

甲状腺是贮存及分泌TH的重要器官，TH广泛存在于机体的各组织器官,调节糖类、脂肪、蛋白质的合成和分解代谢,并在机体生长发育、物质代谢及能量消耗等生理进程中发挥关键作用。骨骼肌是TH的重要靶组织之一，生理水平的TH可调节人体骨骼肌中的多个基因，左旋甲状腺素（L-T4）治疗可诱导骨骼肌中miR-206/miR-133b初级转录物的大量下调[10]。然而在针对血清中miRNA表达谱的研究中则未发现不同甲状腺状态下miRNA的表达存在显著差异[11]。

3 miRNA在甲减发病中的作用

3.1 miRNA与自身免疫性甲状腺炎

甲状腺功能减退症病因复杂，以原发性甲减多见，约占99%，其中自身免疫、甲状腺手术、甲亢碘131治疗三大原因则占90%以上，其他包括放射性碘或抗甲状腺药物的使用，以及与甲状腺无关的药物如胺碘酮，锂和干扰素的不良反应等[12]。桥本甲状腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）作为自身免疫性甲状腺疾病中的最常见类型，是成人原发性甲减的重要原因[13]。研究表明，多种miRNA的异常表达与HT的发生、发展、预后之间存在密切联系，如miR-142-5p被认为可能通过调控紧密连接蛋白-1(tight junction protein 1,CLDN1)从而影响HT发病，而miR-155则可通过影响Th1、Th17等CD4+T细胞亚群分化以及分泌炎症性细胞因子参与HT的发生、发展。目前已有针对miRNA的靶向药物处于临床试验阶段，并取得了一定疗效，未来有望将miRNA靶向治疗剂应用于HT诊疗中，从而达到早期治疗HT，防止自身免疫性炎症过程中甲状腺滤泡细胞的破坏及其向甲减的进一步转化。

3.2 miRNA与先天性甲状腺功能减退症(congenital hypothyroidism,CH)

CH即出生时即诊断的甲状腺激素缺乏症，是引发婴幼儿精神发育迟缓的最常见原因之一，因可临床干预，故早期诊断及治疗十分重要，部分miRNAs被认为在CH的神经系统发育中起到一定作用。Li W等[14]的研究表明miRNA-124-3p通过靶向程序性细胞死亡蛋白6（Programmed cell death 6,PDCD6）而在CH中发挥神经保护作用，并有望作为婴儿CH的潜在治疗靶标，这在一定程度上阐明了miR-124-3p在CH中的作用和分子机制。

4 miRNA与甲减相关并发症

4.1 脂代谢紊乱

甲减是继发性脂代谢紊乱的常见病因之一，常可见血清总胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、甘油三酯（triglyceride,TG）升高，从而增加心血管事件的发生及死亡率，其发生机制主要与甲状腺激素水平下降有关[15]。一般认为，甲状腺激素能够上调肝脏细胞膜LDL-C受体mRNA表达及3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)活性、参与胆固醇分解代谢等，从而调节脂质稳态，而甲状腺激素不足则会导致相应的脂代谢紊乱。多个研究表明，miRNA的表达改变可能导致血脂水平异常，如miR-22是血脂异常的重要调节因子，并可能作为治疗与肥胖相关的血脂异常的潜在候选miRNA[16]。miR-30c则可通过减少脂质生物合成和脂蛋白分泌，从而调节肝脏和血浆脂质浓度，而提高miR-30c水平可能有助于治疗高脂血症及其相关疾病[17]。

4.2 心脏病变

心脏是甲状腺激素重要的靶器官,甲减常可影响心脏，而出现心肌收缩力减弱、心排血量降低、心脏扩大、心包积液等一系列症状体征，即甲减性心脏病，miRNA可从基因层面辅助阐释其发生发展机制。张司蕾等[18]对甲减大鼠心肌中miRNA表达情况进行研究，发现miR-206表达升高，，胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)表达水平下降，而这种变化又可被L-T4所纠正，进而指出，甲减大鼠心肌miR-206可能通过对IGF-1蛋白的转录后抑制作用，参与甲减性心脏病变发生。

4.3 脑发育异常

妊娠期甲状腺激素缺乏常可严重影响胎儿大脑发育，多种miRNAs在甲减所致脑发育异常中也有差异表达。邢倩等[19]对甲减及正常Wistar母鼠后代脑组织的差异性表达miRNA谱进行分析，结果发现甲减胎/仔鼠脑组织中 mir-206、mir-324-5p、mir-34c、mir-204、mir-194、mir-146b、mir-532-5p、mir-384-5p、mir-215、mir-212增高2倍以上，而mir-200b、mir-200c、mir-217、mir-672、mir-139-5p、mir-376-3p、mir-672、mir-204、mir-335、mir-376-3p等表达则降低50%以上。研究组进一步研究发现[20]，miR-206可通过靶向BDNF的3'-UTR，从而参与妊娠早期甲状腺功能减退症母鼠后代的脑发育。神经干细胞（neural stem cells,NSCs）是甲状腺激素的主要靶标，miR-125b-5p可能通过靶向调控Stat3从而影响NSCs分化，进而参与抑制甲减发展进程，,在一定程度上阐明了甲状腺激素在大脑发育过程中的潜在机制[21]。又有研究表明，miR-124可抑制甲状腺功能减退大鼠海马神经元凋亡，从而保护甲减大鼠的神经细胞[22]。

5 亚临床甲减（subclinical hypothyroidism,SCH)

5.1 SCH与脂代谢紊乱

SCH可导致血脂水平的变化，，并与动脉粥样硬化（atherosclerosis，ATH)密切相关，miRNA则作为基因调节剂参与了SCH患者的ATH及血脂异常进程。张新焕等[23,24]将受试者分为正常组（n=22）、单纯SCH组（n=20）、SCH伴ATH组（n=21）以及单纯ATH无SCH（n=22）组，观察6种与动脉硬化发生发展过程密切相关的血清 miRNA（miR-21-5p、miR-125a-5p、miR-126-3p、miR-210、miR-221-3p、miR-222-3p）的差异表达。结果表明，miR-21-5p在SCH以及SCH合并ATH患者中均存在特异性表达上调，miR-125a-5p，miR-126-3p，miR-221-3p和miR-222-3p的下调可能是SCH合并ATH或者单纯ATH患者中动脉粥样硬化的表现，而miR-126-3p则在所有ATH患者中均存在特异性表达。张立亚等[25]对小鼠SCH模型的肝脏miRNA表达谱进行研究，发现miR-10b-5p、miR-24-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-34a-5p、miR-125b-5p、miR-130a-5p和miR-199a-5p等表达量显著下调，进一步通路分析表明，miR-34a-5p/Aldh3a2、miR-34a-5p/Txn、miR-130a-3p/Eef1b、miR-130a-3p/Psap以及miR-24-5p/Selenbp2等通路调控关系在SCH脂代谢紊乱的发病中起到一定作用。

5.2 SCH与冠心病

SCH在冠心病的发展中也起到关键作用，Quan X等[26]研究了冠心病患者中循环miRNA的表达情况，表明miR-146a水平与SCH患者的冠心病发病率及冠状动脉粥样硬化的严重程度相关，而血浆TSH水平与miR-146a水平正相关，循环miR-146a可能是SCH患者冠心病的潜在生物标志物。何雨峰等[27]同样对循环miR-146a水平对SCH病人冠心病的预测价值进行了探讨，结论认为miR-146a是SCH患者冠心病发病的独立危险因素,血浆miR-146a水平对SCH患者冠心病发病具有一定的预测价值。

5.3 SCH与妊娠期流产

目前SCH已被证明与多种妊娠并发症有关，包括自然流产（spontaneous abortion,SA），miRNA在一定程度上对其机制做出阐述。Zhou Y等[28]通过测定SCH，SCH与SA（SCH+SA）患者以及SA患者和健康对照（HC）患者的血清miRNA表达，指出miR-940或miR-486-5p可能是SCH患者SA早期诊断的潜在预测生物标志物，有助于临床用于早期诊断及干预。

6 miRNA在中医药中的应用

MiRNA理论为中医药的发展提供了新的切入点，目前其在中医药中的运用主要体现在疾病的中医辨证分型、发病机制及中药药效阐释等方面，具体如血瘀证的辨证分型及诊断网络的构建、乙型肝炎肝硬化中医综合征的发展评估、对川楝子诱导小鼠肝脏损伤的机制阐述及作为潜在的生物标志物评估中药临床疗效的运用等方面。

6.1 miRNA与中医辨证

证侯是对中医学对疾病当前阶段的病位、病性等所作的结论，体现着从分子、细胞到组织、器官、系统水平的综合动态变化。而miRNA参与人体多种生物学过程，并具有特异性及时空性的特点，参与多种疾病的发生发展。因此，miRNA及其表达的动态演变过程和与临床上出现的症状、体征必然有内在联系，并参与证侯的发生和动态演变[29]。目前已有研究表明，miRNA作为潜在的生物标志物，用于评估慢性乙型肝炎[30,31]、乙型肝炎肝硬化[32]、胰腺癌[33]等疾病中不同中医证候的分类及演变趋势，在一定程度上阐述了不同中医证侯在这些疾病中的分子基础。Liao J[34]等对血瘀证的研究则表明，miR-146b-5p，-199a-5p和23种靶向mRNA形成了血瘀证的诊断网络，可能为血瘀证的诊断提供更客观的应用标准。

6.2 miRNA与中医体质

体质是人体受先天因素和后天因素的影响从而在形态和功能等方面所具备的固有相对稳定的特性。中医体质理论认为，体质在一定程度上决定了疾病的易感性及其发展方向，对体质的准确辨识可以帮助临床医生进行临床决策。miRNA与体质也有一定关系。体质不同的人可能具有不同的miRNA表达谱。有研究[35]表明，阳虚质与阴虚质拥有不同的miRNA表达谱，甲状腺激素信号传导途径在两种体质中均存在，这些调节甲状腺激素信号通路的miRNA可能与阳虚质的冷不耐受与阴虚质的热不耐受有关。因此，有望通过miRNA差异表达进一步阐述中医体质的不同特征，从而为体质的微观辨别提供思路。

6.3 miRNA与中药作用机制

miRNA在转录后水平对基因进行调控，被证实与多种疾病的发生与发展相关，而外源性来自中药的miRNA可吸收入体内稳定存在，并调节哺乳动物基因表达，为从miRNA角度阐释中药调控机制提供思路，并有潜力作为口服的基因靶向治疗剂进行研究[36,37]。多个研究已经表明，中药可以通过调控miRNA及其相应通路，进而在疾病治疗中发挥作用。如中药复方和气散可能通过影响miRNA-144-3p及相应信号通路，改变血清激素水平、恢复病变卵巢形态、改善胰岛素抵抗等从而改善多囊卵巢综合征[38]。滋阴和清火中药复合制剂可通过调控下丘脑Lin28/let7途径在性早熟模型大鼠中起到一定作用[39]。中药泻肺利水方可通过下调心肌中miR-25-3p和miR-25-5p的表达，上调心肌肌浆网Ca2+-ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a,SERCA2a）心肌mRNA表达，改善在心力衰竭大鼠的心功能[40]。

6.4 miRNA与中药肝毒性

中药的肝毒性是中药使用中不可忽视的临床问题，多种中药都被报道肝毒性，如何首乌、黄药子、川楝子等，然而因为中药成分复杂，其引起肝毒性的毒理学机制很大程度上未被阐明。黄药子作为瘿病常用中药，具有散结的作用，常用与甲状腺结节等的中医诊疗之中。但是其肝毒性不可忽视，miRNA在阐述其肝毒性发生机制方面也取得了一定进展。杨睿等基于miRNA进行黄药子肝毒性生物标志物的筛选及毒性机制的探索研究表明，miR-5099可以作为黄药子诱导急性肝毒性的特异性血清生物标志物。而miR-200a-3p，miR-5132-5p和miR-5130及其控的质网蛋白应激通路，以及靶基因Dnaja1可能在黄药子乙酸乙酯提取物诱导的急性肝毒性中发挥了重要的调控作用[41]。盛云华等对黄药子及山豆根所致的肝损伤进行研究，认为miR-23和miR-142-5p可作为黄药子致肝损伤早期敏感指标之一[42]。川楝子味苦有小毒，有疏肝行气、止痛、驱虫等功效，临床常用于瘿病的治疗之中，其肝毒性同样引起临床广泛关注。部分研究对miRNA在川楝子引起肝毒性的机制进行了探讨，Zheng J等[43]通过对川楝子诱导的肝损伤小鼠肝脏样品mRNA和microRNA表达谱进行分析，指出经川楝子提取物处理后8种miRNA和1,723种mRNA有显著改变。对于8个差异表达的miRNA，收集了它们预测的靶基因，并选择了最终的125个基因和4个miRNA（miR-139-5p，miR-199a-5p，miR-2861和miR-3960）进行研究，结果表明，川楝子提取物引起了小鼠细胞生长和增殖，基因表达和细胞发育等多方面的细胞功能紊乱，推测氧化应激反应引起的肝细胞坏死是川楝子提取物的主要肝脏毒性。研究人员在随后的实验进一步中指出[44]，血清miR-370-3p可能通过升高p21蛋白和细胞周期蛋白E(cell cycle protein E,cyclin E)加剧细胞毒作用，产生肝毒性，从而揭示了川楝子诱导小鼠肝脏损伤的机制。miRNA在甲减中医药治疗中的应用目前尚未见文献报道，未来有待进一步深入研究。

综上所述，miRNA在甲状腺的生理功能以及甲减的发病、并发症等进程中发挥重要作用，有望作为疾病治疗的靶点应用于临床中。此外，miRNA在中医药中的应用也取得了一定进展，未来有待进一步将甲减不同证型及正常对照人群进行miRNA的基因表达谱分析，筛选甲减各证型的差异基因，从基因层面对甲减的证型本质和病理机制进行探索，并试图阐释甲减不同中医证候形成的生物学基础及发生机理，为未来完善甲减不同证型的生物标志物及靶点干预提供客观科学依据。