中药促凋亡机制干预甲状腺癌的实验研究进展＊

李 俊，魏军平，柏力萄，李 菲，吴芳莹

（中国中医科学院广安门医院 北京 100053）

甲状腺癌是内分泌系统和头颈部最常见的恶性肿瘤，超过90%为分化型甲状腺癌[1]。近年来发病率在全球都呈上升的趋势，据报道，在我国女性中，甲状腺癌是30岁以前最常诊断的癌症[2]。目前甲状腺癌的治疗方法主要包括手术治疗、术后131I治疗和促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）抑制治疗，如手术禁忌、患者不接受手术或肿瘤不摄碘，可采取化学疗法，但化疗疗效欠佳且毒副反应大。细胞凋亡的调节是一种有效的抗肿瘤治疗方法，这可以通过抑制正常组织中的细胞凋亡反应或增加对癌组织的凋亡反应来实现。分子靶向药物治疗可以在细胞分子水平上针对包括参与肿瘤细胞分化、凋亡、细胞迁移、浸润、转移等过程的致癌位点而发挥作用，已成为当前的研究热点。根据现有的实验研究，中药及其活性成分对甲状腺癌具有多方面的干预作用，其作用分子和基因靶点层面变化密切相关。本文旨在从促凋亡机制方面对中药干预甲状腺癌的实验研究作一总结。

1 细胞凋亡与甲状腺癌

细胞凋亡是细胞经历死亡以控制细胞增殖或响应DNA损伤的机制，其特点是激活效应半胱天冬酶（Caspase）和切割对细胞活力至关重要的蛋白质，导致DNA片段化，染色质浓缩，细胞皱缩和膜起泡。由于内部或外部刺激而被诱导进行程序自杀的细胞会发生细胞凋亡，尽管对触发细胞凋亡的详细信号传导途径的理解是不完整的，但是该过程由许多复杂蛋白质控制，这些蛋白质通过各种信号分子激活并排列在顺序信号传导模块中[3]。细胞凋亡主要通过两个途径发生，第一为外在或细胞质途径，是通过Fas死亡受体，肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）受体超家族成员触发的。Fas在甲状腺癌中过度表达，表明其可能刺激增殖并赋予甲状腺癌细胞生存优势。第二是内在或线粒体途径,当受到刺激时，细胞色素C从线粒体释放并激活凋亡信号。这两种途径具有共同的最终途径，即涉及激活一系列Caspase，裂解调节和结构分子，最终导致细胞死亡[4]。凋亡异常是许多恶性肿瘤的明显特征，主要是促进凋亡基因与抑制凋亡基因表达失衡，使细胞存在持续恶性增殖的可能[5]。有研究发现甲状腺癌组织中有较高水平细胞凋亡，Fas、FasL、Bcl-2及Bax的表达均明显增强，提示在甲状腺癌组织中也存在高水平的细胞凋亡，可能与肿瘤细胞增殖快而凋亡率相应增加有关[6]。因此，从细胞凋亡角度来看，恢复肿瘤细胞的凋亡信号的传导，利用细胞凋亡可以将受到抑制的细胞凋亡机制重新激活，从而做到调控肿瘤细胞的程序性死亡，达到抑制癌症细胞的目的。因此针对细胞凋亡通路的研究，对于肿瘤的抑制以及相关靶标药物的研究具有重要意义。一些药物可通过抑制或下调抗凋亡活性，或通过细胞凋亡效应物或启动子的刺激或上调，更直接地靶向操纵细胞凋亡，具有治疗细胞凋亡途径异常的癌细胞的潜力。

2 中药促凋亡机制与甲状腺癌

2.1 下调抗凋亡基因Bcl-2

Bcl-2蛋白家族是内在或线粒体凋亡途径最重要的调节因子之一，包括促凋亡成员，如Bax，Bak，Bad，Bcl-Xs，Bid，Bik，Bim和Hrk，以及抗细胞凋亡成员如Bcl-2，Bcl-XL，Bcl-W，Bfl-1和Mcl-1[7]。Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调节因子并在许多恶性肿瘤中过表达，Bcl-2的表达增加导致对化学治疗药物和放射疗法的抗性，而降低Bcl-2表达可促进对抗癌药物的凋亡反应。此外，过表达Bcl-2可能导致细胞在细胞周期分裂的G0期积累，并导致化学抗性[8]。响应细胞凋亡刺激，外部线粒体膜变得可渗透，导致细胞色素C和第二个线粒体衍生的半胱天冬酶活化剂的释放。细胞色素C（Cytochrome C,Cyto C）从在细胞质中释放，即与凋亡酶激活因子1（Apaf-1）相互作用，募集并激活Caspase-9，导致Caspase-9酶原的活化并激活Caspase-3，激活的Caspase-3导致细胞核裂解和细胞核破裂[8]。Apaf-1，Caspase-9和Cyto C的复合物称为凋亡小体。抗细胞凋亡Bcl-2成员可通过阻断Cyto C的释放起到细胞凋亡的抑制作用。夏枯草能抑制TT细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与活化线粒体凋亡通路有关：夏枯草作用TT细胞24 h后线粒体膜的通透性增加，Bcl-2蛋白表达水平减少，Cyto C从线粒体释放，引起活化的Caspase-3蛋白表达增加[9]。山慈姑也能通过下调抗凋亡基因BCL—2的途径来实现促进甲状腺癌细胞的凋亡的作用[10]。

2.2 调节Bcl-2/Bax平衡

Bax是最为典型的促凋亡蛋白，自身能够形成二聚体或者与抑凋亡蛋白Bcl-2形成异二聚体，促使凋亡信号传递给Caspase家族，诱导细胞凋亡。但这种作用更多地取决于Bcl-2和Bax之间的平衡，Bcl-2/Bax比值影响着细胞对凋亡刺激因子的敏感性和抵抗性。促凋亡蛋白经历翻译后修饰，包括去磷酸化和切割，导致其活化和转运至线粒体，引起细胞凋亡[11]。有研究结果表明甲状腺癌组织中Bax的阳性表达率明显低于癌旁正常组织[12]，提示Bax在甲状腺癌中可发挥抑癌作用。夏枯草能抑制人甲状腺癌K1细胞增殖并诱导其凋亡，其机制可能与Bcl-2/Bax比值降低导致线粒体膜的通透性增加所引起的线粒体凋亡有关[13]。姜黄素也可通过上调Bax表达、下调Bcl-2表达来抑制人甲状腺癌B-CPAP细胞生长并诱导细胞凋亡[14]。

2.3 抑制cMyc基因表达

cMyc是常见的原癌基因，其产物为核重要的转录调控因子，可调节10%-15%参与细胞周期，发育，凋亡和代谢的的人类基因[15]，具有促进细胞增殖和诱导细胞凋亡的双重功能，抑制cMyc基因表达可以抑制细胞从G1期进入S期，从而抑制肿瘤的增殖[16]。cMyc可以选择性地微调许多对细胞生长和癌症进展至关重要的重要基因的表达，其介导的丝氨酸生物合成途径的激活对于营养缺乏条件下的癌症进展是至关重要的[17]。中药玄参和山慈菇有抑制甲状腺癌SW579细胞增殖的作用，可能与下调cMyc表达有关，不同浓度的玄参与凋亡相关基因与cMyc表达具有量效关系[18,19]。

2.4 下调Survivin基因和蛋白表达

Survivin是IAP（The inhibitor of apoptosis family）基因家族成员，参与程序性细胞死亡和有丝分裂[20]，它在各种恶性肿瘤中大量表达，但在大多数正常分化组织中检测不到。Survivin蛋白是最具肿瘤特异性的分子之一，其拮抗细胞凋亡促进肿瘤相关的血管生成，并作为各种抗癌疗法的抵抗因子[21,22]，还是肿瘤发病和复发的诊断生物标志物。有研究表明所有甲状腺肿瘤中Survivin蛋白的表达均显着上调，Survivin表达的上调可能是甲状腺上皮癌中去分化的分子标志[23]。五味子多糖能有效抑制人甲状腺癌细胞株SW579中Survivin基因表达，诱导SW579细胞凋亡并抑制肿瘤细胞增殖[24]。黄药子则能明显下调人甲状腺癌细胞株SW579中Survivin mRNA和蛋白的表达而诱导其细胞凋亡[25]。另有研究指出Survivin表达下调还有助于甲状腺癌细胞的化疗耐药[26]。因此，中药对Survivin基因和蛋白的干预作用是癌症药物研究的潜在靶标。

2.5 抑制P13K/AKT信号通路

磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K/AKT）信号通路在细胞生长增殖等调节中起重要作用，并参与肿瘤细胞恶性增殖、转移和血管新生等过程[27]。PI3K由p85调节亚基的异二聚体和催化亚基p110组成，其中只有催化亚基的同种型中PIK3CA在人类癌症中的基因中具有致癌突变或扩增作用[28]。PIK3CA可被各种特异性结合蛋白质因子激活，包括Ras和膜受体的各种信号，激活后PIK3CA磷酸化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol(4,5)bisphosphate,PIP2）以产生磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（phosphatidylinositol(3,4,5)bisphosphate,PIP3），其将Ser/Thr激酶蛋白激酶B（protein kinase B,PKB，又称Akt）定位于细胞膜，并被磷酸肌醇依赖性激酶（phosphoinositide-dependent protein kinase,PDK）激活。活化的AKT磷酸化下游靶标，包括FoxO转录因子、mTOR激酶，这些AKT靶标在调节关键细胞功能中发挥关键作用，包括增殖、凋亡、葡萄糖稳态等[29]。PI3K/AKT通路的异常激活在甲状腺癌发生中发挥广泛作用，可以促进分化的肿瘤向未分化进展[30]。靶向PTEN（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）肿瘤抑制基因的遗传改变是人类癌症中最常见的体细胞突变，癌细胞中缺乏功能性PTEN导致PI3K途径的下游靶标的活化，这种作用在乳腺癌和甲状腺癌的发病率升高有关[31]。葛根素可抑制甲状腺癌细胞活力和诱导凋亡，机制可能与诱导ROS产生及抑制P13K/AKT信号通路有关[32]。小檗碱可以调节甲状腺癌细胞中PI3K/AKT和MAPK信号通路，从而导致线粒体凋亡及G0/G1细胞周期停滞[33]。因此PI3K/AKT途径可能是中药治疗甲状腺癌的有前景的治疗靶点。

2.6 下调PARP的水平

多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)是DNA修复酶，是细胞凋亡核心成员Caspase的切割底物,在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用，此外它还参与肿瘤发展及炎症反应过程中转录因子的调节[34]。PARP家族中以PARP-1研究最多，在DNA受到损伤后其被激活，迅速募集到损伤DNA处，通过修复这些损伤从而使细胞重新进入细胞周期，而抑制PARP可降低DNA修复功能[35]。多项研究均表明抑制PARP-1能增强放疗及多种DNA损伤型化疗药的细胞毒作用[36]，PARP-1抑制剂已被开发为增强基因毒性损伤敏感性的手段，并且正在与放化疗和DNA修复能力缺陷的肿瘤中进行临床试验[37]。尽管如此，PARP-1介导的转录控制在人类恶性肿瘤中的机制和影响仍然很大程度上未被探索。PARP-1在雌激素受体-α转录激活中的作用提示PARP-1在激素依赖性癌症中的潜在功能，最近的研究前列腺腺癌依赖于雄激素受体（AR）活性来生长和存活，并且对化疗具有很大的抵抗力[38,39]。有研究表明，PARP-1抑制剂能增加钠-碘共同转运体（sodium iodide symporter,NIS）的mRNA的水平，并导致BCPAP细胞摄碘的增加，增加131I浓集在甲状腺滤泡状细胞而达到杀伤甲状腺癌细胞的目的[40]。冬凌草甲素对甲状腺癌BCPAP细胞增殖有抑制作用，其机制可能是通过上调了被剪切PARP而诱导细胞凋亡[41]。虫草素诱导的CGTH W-2细胞凋亡是由Caspase7-PARP途径介导的，而AR参与虫草素的凋亡作用[42]。今后进一步探究PARP对肿瘤抑制作用的机制和对细胞周期的影响，可为甲状腺癌的临床治疗提供实验基础。

2.7 抑制MAPK信号通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)为普遍存在于真核细胞中的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其通过细胞表面受体把多种细胞外理化刺激传导到胞内。MAPK包含ERK、p38等亚族，MAPK通路在正常的通路活性条件下主要起到促进细胞基因转录、促进细胞增殖、避免细胞过早凋亡等作用[43]。近年来的研究发现MAPK信号通路的过度活化直接参与恶性肿瘤的发生和进展，其过度活化时应能刺激肿瘤细胞的增殖及抑制肿瘤细胞的凋亡[44]。有研究证明在甲状腺乳头状癌中可检测到MAPK信号通路的过度激活，且这种过度活化与BRAF基因的变异有关[45]。小檗碱可以调节甲状腺癌细胞中PI3K-AKT和MAPK信号通路，从而导致线粒体凋亡以及G0/G1细胞周期停滞和抑制性迁移，是治疗甲状腺癌的有希望的化学疗法[33]。姜黄素以剂量依赖性方式显着抑制甲状腺乳头状癌细胞株K1活力并促进其凋亡，这与Bcl-2表达的降低以及PARP的切割的增多有关[46]。因此，对MAPK信号通路在甲状腺癌中促凋亡机制的深入探索及临床研究的开展可为未来的研究提供方向。

3 总结和展望

综上所述，提高对分子遗传缺陷和肿瘤中复杂信号调节过程的理解，尤其是细胞凋亡的调节，可以为新的靶向治疗提供了基础。细胞凋亡机制在中药治疗甲状腺癌的发挥着重要的作用，许多实验研究都结合信号转导通路以及分子、基因等为中药治疗甲状腺癌的促凋亡机制作了有益的探索，将有助于发现新的靶向药物和基于靶向肿瘤特异性分子缺陷的临床试验设计。其他如NF-κB通路、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和Ras等途径也可促进甲状腺癌细胞凋亡，其具体作用还有待进一步探索。但是，应该指出的是中药治疗甲状腺癌的效应途径不仅限于此，大量的实验研究表明，调节甲状腺癌细胞周期、抑制转移和侵袭、诱导自噬、辅助放疗化疗等过程也是其发挥治疗作用方式。因此，中药抗肿瘤的机制可能是通过多靶点、多途径、多层次协同作用的结果，这些具体作用途径及相应的效应机制也应是今后深入的研究的重点，由于目前尚缺乏中药治疗甲状腺癌症大规模临床研究，故中药治疗甲状腺癌的推广尚需进一步研究和验证。