彭心怡 倪锴文 丁阳阳 金红婷 王 萍
川楝子是楝科植物川楝(Melia toosendan Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果实,有小毒,归肝、小肠、膀胱经。2010年版《中国药典》中记载川楝子是一味广泛应用于肝郁化火,胸胁、脘腹胀痛,疝气疼痛及虫积疼痛的药物,但因其毒性,尤其对肝、肾等器官影响较大[1-2],故不可久用。绞股蓝,葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝 (Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino)的干燥根茎或全草,其有效成分绞股蓝皂苷多作为护肝药物用于降低血脂[3]、治疗脂肪肝[4]。目前对于川楝子肝毒性的研究较多集中于急性损伤[5-8]。有研究[6-10]表明,通过白芍、小茴香、延胡索等中药配伍后可减少川楝子肝毒性。而关于川楝子长期用药,长期与其他中药配伍对肝脏损伤的研究报道则较少[8,10]。同时绞股蓝对川楝子肝毒性的减毒作用及其机制的研究未见报道[11]。本文探讨单用川楝子与川楝子、绞股蓝合用18天对小鼠肝脏的影响及作用机制。
1.1 实验动物 清洁级,ICR小鼠28只,雌雄各半,体质量15~20g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物合格证号:SCXK(沪)2012-0002。饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。
1.2 试剂与仪器 川楝子(批号170603)、绞股蓝(批号170601),购于浙江中医药大学名中医馆。谷丙转氨酶(ALT)试剂盒(批号 07495/00003783)、谷草转氨酶(AST)试剂盒(批号 07481/00003747),购于德赛(Diasys Diagnotics Systems GmbH)公司。超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号20170519)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号20170418)、考马斯亮兰试剂盒(批号20171228),均购于南京建成生物工程研究所。HITACHI7020自动生化分析仪,日立株式会社;Varioskan Flash酶标分析仪,赛默飞世尔科技有限公司。
2.1 药物制备方法 川楝子水提醇沉液:将川楝子粉碎至颗粒状,以1:10比例加入超纯水,煮沸后以文火煮30min,水煎2次,合并过滤液,3000r离心,加入分析级无水乙醇,配制至乙醇浓度为70%,4°C冰箱放置过夜,滤去絮状沉淀,回收乙醇,将上述水提醇沉液浓缩至生药含量10g/mL,置4°C冰箱避光保存备用。川楝子绞股蓝水提醇沉液(以下简称川绞水提醇沉液)中川楝子与绞股蓝配比为8:2,其余均同前。临用前,用蒸馏水分别配置成所需浓度的溶液。
2.2 分组及给药方法 28只ICR小鼠随机分为正常组8只,川楝子组10只,川楝子绞股蓝组(川绞组)10只,每组雌雄各半。小鼠在适应性饲养7天后,开始给药,川楝子组予川楝子(生药)100g/kg;川绞组予125g/kg,其中川楝子含量100g/kg、绞股蓝含量25g/kg灌胃。各组按0.2mL/10g灌胃给药。正常组给予等容积的蒸馏水。
2.3 指标取材及检测方法 给药18天后,禁食不禁水24h,第19天,称取体质量,眼球静脉丛取血,采用全自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST);颈椎脱臼法处死小鼠,摘除肝脏计算肝脏指数(肝脏重/体质量×100%),取部分肝组织用0.9%NaCl溶液制成10%肝匀浆,采用黄嘌呤氧化酶法测试超氧化物歧化酶(SOD)活力、采用TBA法测量丙二醛(MDA)含量。
2.4 慢性肝损伤模型 目前临床上川楝子致急性肝损伤实验多用灌胃给药2h后进行取血、摘除肝脏检测的方法[8],而给小鼠灌胃并于24h后进行肝功能等检测[9]观察长期肝毒性和慢性肝损伤[7,12-13]。故本实验按川楝子(生药)100g/kg剂量灌胃18天,制造慢性肝损伤小鼠模型。
2.5 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行统计处理,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用成组t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
实验第9天,因灌胃失误,川绞组小鼠死亡1只。
3.1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较 与正常组比较,川楝子组小鼠血清ALT值无明显变化,AST值上升(P<0.05),肝脏指数增高不明显。与川楝子组比较,川绞组ALT值、肝指数无明差异,AST有下降趋势,但差异无统计学意义,与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。故在连续给药18天后,川楝子组存在一定肝毒性,川绞组显示有降低该毒性的趋势。见表1。
3.2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA含量比较 与正常组比较,川楝子组小鼠肝组织MDA含量明显下降(P<0.01),SOD 活性变化不明显,SOD/MDA 显著
表1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较(±s)
表1 各组小鼠血清ALT、AST及肝脏指数比较(±s)
注:与正常组比较,*P<0.05;ALT:谷丙转氨酶;AST:谷草转氨酶
组别正常组川楝子组川绞组鼠数8 10 9 ALT(IU/L)40.60±10.16 42.26±11.07 44.13±6.71 AST(IU/L)120.00±35.05 169.78±55.65*155.17±33.97肝指数(%)4.87±0.46 4.89±0.53 4.93±0.29
升高(P<0.01);川绞组小鼠肝组织MDA含量较正常组明显下降(P<0.01),SOD活性变化不明显,SOD/MDA 高于正常组(P<0.05),低于川楝子组(P<0.05)。见表2。
表2 各组小鼠肝组织SOD活性、MDA含量比较(x±s)
单次灌服一定剂量川楝子对小鼠有急性肝毒性,且毒性有时效与量效关系[1,14],目前发现该损伤机制主要与肝细胞损伤、脂质过氧化、炎症反应、线粒体功能等失常有关[5-6],而通过与其他中药配伍[10]后可减少肝毒性。绞股蓝,主要有效成分为绞股蓝皂苷、绞股蓝多糖,在连续给药后起一定保肝作用,有抑制氧化应激,减少脂质过氧化与自由基生成[15-16]、抑制炎症反应[17]、抑制线粒体通路介导的肝细胞凋亡[11]等药理活性。故根据川楝子损肝机制与绞股蓝保肝机制,推测两药存在配伍解毒的可能性。
本实验结果显示,川绞组AST值与正常组相比无统计学意义(P>0.05),并且较川楝子组结果有降低趋势,故可能存在抗川楝子致肝损伤作用。川楝子组的AST值显著上升,ALT值未上升,该结果与齐双岩[13]长期用药实验结果不同。但在毒性时效性研究中有报导称,川楝子肝毒性出现早、持续时间短暂,给药24h后ALT值可有恢复正常的情况[1],也有给药持续时间长,转氨酶进行性消耗,出现适应性肝损伤现象的报导[7]。在利福平建立的慢性肝损伤模型中,用药14天后ALT也未出现统计学差异[18],故考虑ALT值未上升是川楝子久用发生了适应性肝损伤的结果。由于川楝子造成的肝损伤属于化学性肝损伤,所以本实验通过检测SOD活性与MDA含量,了解长期用川楝子与川楝子绞股蓝对肝脏在氧化应激、脂质过氧化方面的影响。SOD催化超氧阴离子自由基还原为过氧化氢,其活力越高,反映肝脏组织清除氧自由基的能力越强[19],本实验中三组并无明显差异(P>0.05),提示川楝子组、川绞组并不影响肝细胞SOD活力。MDA作为膜脂过氧化重要产物,含量越高,则间接反映肝脏细胞受氧自由基攻击的程度越严重;SOD与MDA的比值可用于反映肝组织脂质过氧化的程度,比值越高氧化程度越小[8,20]。本研究结果显示,川楝子组与川绞组MDA含量均下降(P<0.01),SOD/MDA 比值上升(P<0.05,P<0.01),尤其是川楝子组结果与之前文献报导结果相反,提示川楝子提取液可能影响肝细胞内MDA的生成,或者川楝子不以氧化应激途径损伤肝细胞,或是连续给药可抑制细胞内脂质过氧化。在氯丙烯的毒理研究中也出现SOD活性下降然而MDA提示过氧化程度降低的结果[21],故长期用川楝子可能并不能使MDA含量增多。近年研究[22]发现,MDA在体内可能存在双重角色,并非只提示过氧化程度,有实验[23]发现适当高剂量MDA可促进葡萄糖刺激胰岛素分泌作用,升高ATP/ADP比率等,所以该组实验结果及意义仍需进一步验证探讨。本研究显示,川绞组与正常组相比MDA含量下降显著(P<0.01),与川楝子组相比含量上升(P<0.05),提示绞股蓝与川楝子在脂质过氧化中存在对抗作用,但仍可降低过氧化产物含量,且川绞组ALT值、AST值与正常组相比无差别(P>0.05),所以认为川楝子与绞股蓝合用可缓解其对肝脏造成的损伤。
川楝子性苦味寒,有疏肝泄热、行气止痛、杀虫的功效。绞股蓝性凉味甘苦,具益气健脾、化痰止咳、清热解毒的功效。而两药性寒凉,味苦,性味上不存在阴阳明显对立的情况,川楝子疏肝与绞股蓝健脾配伍,即使长时间运用川楝子疏肝泄热也不至伤脾胃,故临床存在配伍的可能性。