日本血吸虫虫卵分泌物小RNA的高通量测序

徐桂娜 何雪梅 周晓蓉 曾凡胜 秦志强

血吸虫病是严重危害群众身体健康，阻碍经济社会发展的寄生虫病[1]。随着我国血吸虫病防治工作的不断深入，当前我国血吸虫病已呈低度流行态势[2]。但目前经典沿用的诊断方法都存在不同程度的缺陷，越来越难以满足当前防治的需求[3]。因此，现阶段迫切需要建立与发展精准的检测方法用于我国血吸虫病防治[4]。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长18～30 nt高度保守的内源性单链非编码小RNA(small RNA，smRNA)分子[5]，通过结合互补mRNA调节基因表达，参与细胞生长、分化、增殖与凋亡、新陈代谢等多种生命活动[6]。miRNA在血吸虫生长发育、寄生及致病机制中可能具有重要作用[7]。因此，对miRNA在日本血吸虫病中的深入研究可为药物靶点预测、疫苗研制及诊断开辟新的思路。近年来，围绕血吸虫miRNA的鉴定、靶基因识别及诊断展开了较多研究。目前研究miRNA表达的主要方法有Real-Time PCR、miRNA芯片以及第二代测序[8]。本文通过构建日本血吸虫虫卵分泌物(egg secreted product, ESP)的小RNA文库，应用Illumina NextSeq 500第二代高通量测序技术对小RNA文库进行测序，再结合生物信息学分析方法，快速鉴定保守的miRNA，筛选出差异表达的miRNA，为下一步验证血吸虫感染患者血液中的miRNA靶标并为发展基于miRNA的分子诊断方法奠定基础。

材料与方法

一、日本血吸虫ESP制备

参照朱蓉[9]等报道的方法制备日本血吸虫虫卵。新鲜的日本血吸虫虫卵用0.9%生理盐水和RPMI1640培养基分别漂洗3次，用RPMI1640培养基于37℃、5%CO2培养12 h后，吸取培养上清，1200×g、4℃离心10 min，收集上清，即为虫卵分泌物(ESP)，虫卵ESP用0.45 μm的无菌滤器过滤后置-80℃保存备用。

二、ESP总RNA制备

使用Trizol试剂(Invitrogen，美国)提取日本血吸虫虫卵ESP总RNA，利用日本Takara提供的专用试剂37℃孵育30 min以清除残留的基因组DNA，使Oligotex mRNA MidiKit(Qiagen，德国)分离纯化样品mRNA。RNA的质量和含量通过使用紫外可见分光光度计(Nanodrop ND-1000，LabTech，美国)检测吸光度260 nm/280 nm(A260/A280)进行测定，完整性通过1.5%(w/v)凝胶电泳进行检测。

三、测序文库构建和RNA高通量测序

按照小RNA测序文库构建流程对纯化后的日本血吸虫ESP总RNA进行3′端接头连接，5′端接头连接、反转录、扩增，cDNA文库大小选择，纯化等步骤，完成测序样本文库构建。构建好的文库利用荧光染料法(Picogreen)和荧光光度计方法定量文库，并用Agilent 2100 Bioanalyzer(美国)和ABI StepOnePlus Real Time PCR System(美国)进行质检，将每个质检检测合格的样品稀释至终浓度10 nmol/L后，交由上海派森诺生物技术有限公司，使Illumina NextSeq 500测序仪(美国)进行测序。

四、原始数据预处理、数据过滤及长度分布统计

应用质控工具fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)对测序原始数据进行预处理，去除接头序列以及低质量序列(包括模糊碱基N，碱基质量小于20以及长度小于18 nt的序列)，得到可供后续分析的序列，并进行处理结果统计及长度分布统计。

五、比对注释，鉴定已知miRNA

应用CLC genomics_workbench 5.5商业软件将预处理后的序列与最新Sanger miRBase数据库比对，比对过程不允许有碱基错配。另与其他非编码数据库ncRNA、piRNA和Rfam数据库比对，允许与目标序列有2个碱基错配、允许比目标序列两端各缩短或延长2个碱基。

六、miRNA表达水平

采用DEGseqR语言包结合perl脚本将ESP按照分组情况进行miRNA表达量的比较分析。使用标准化数值(Transcripts per million,TPM)进行差异分析。

结 果

一、总RNA提取质量评估

RNA的质量和含量通过使用Nanodrop ND1000(LabTech，美国)检测，吸光度260 nm/280 nm(A260/A280)的值为2.33，完整性通过1.5%(w/v)凝胶电泳进行检测，RNA完整性计数RIN(RNA Integrity Number)为2.4(见图1)。

图1 总RNA提取质量分析

二、原始数据预处理、数据过滤

本研究利用IlluminaNextSeq 500测序平台对血吸虫ESP进行测序分析获得原始阅读序列读数(Raw Reads)为23 348 390条。应用fastx(fastx_toolkit-0.0.13.2)对日本血吸虫虫卵ESP测序，原始序列数(reads)进行预处理，去除接头序列以及低质量序列(包括模糊碱基N，碱基质量小于20以及长度小于18 nt的序列)，最终获得ESP过滤后的序列读数为13 190 761条。去掉重复序列前ESP序列长度分布统计在30 nt处出现最高峰；去重后ESP序列长度分布统计主要分布在26～30 nt处(见图2)。

横轴为不同的序列长度，纵轴为对应长度的序列丰度(*10000)

三、比对注释及miRNA表达

将测序所得小 RNAs序列进行比对注释，其中有注释的小 RNA为84 735条，约占12.6%。将构建文库中样品表达的miRNA与最新Sanger miRBase数据库中的miRNA比对，ESP文库中有270条序列可与日本血吸虫的miRBase数据库比对上，已知的成熟miRNA有12个，未发现有新miRNA。miRNA表达量分析显示sja-miR-3488为表达量最高的miRNA，sja-miR-36-3p和sja-miR-71a表达量也较高，3种miRNA表达量占91.8%(见表1)。

表1 miRNA表达定量分析

讨 论

miRNA在哺乳动物血浆、血清、尿液等体液中稳定存在[10，11]，近年来已相继发现循环miRNA可作癌症的生物标志物，是研究者高度关注的新诊断靶点[12～14]。miRNA亦用于诊断多种其他感染性疾病的生物标志物，比如肺结核[15，16]、脓毒病[17，18]、病毒性肝炎[19，20]等。近年来，人们在血吸虫感染宿主的血液[21，22]、粪便[23，24]中检测出了血吸虫虫体、虫卵来源的循环DNA，为血吸虫病的核酸诊断研究开辟了新的途径。miRNA在日本血吸虫虫卵和虫体有特异性表达[25]，有可能成为特定生物标志物。日本血吸虫虫卵sja-miR-71b-5p、sja-miR-71、sja-miR-36-3p高表达[25]，sja-miR-125b在成虫呈显著表达[26]，提示上述miRNAs分别具有作为虫卵和成虫阶段特异标志物的潜力。Hoy等[27]在感染曼氏血吸虫小鼠血清中鉴别出宿主源性和寄生虫源性的miRNA，并在感染患者血清中检测出的三种寄生虫源性miRNAs，即miR-277、miR-3479-3p和miR-bantam，上述三种miRNAs可作为血吸虫感染的新标志物。Cai等[28]发现寄生虫源性的特异循环miRNAs sja-miR-277和sja-miR-3479-3p是诊断日本血吸虫病的潜力靶标。以上研究显示血吸虫病患者血清或血浆中出现特异的miRNA，且具有稳定性高、结合灵敏度高和检测特异的特点。虫卵作为主要致病因素可促使血吸虫感染的发生，并且逃避或操纵宿主免疫反应，因此对血吸虫虫卵ESP miRNA的研究有助于发现新的干预目标[25，29]。为鉴定日本血吸虫ESP miRNAs，本研究基于Illumina高通量测序技术对日本血吸虫ESP miRNA进行了测定，获得了13 190 761个可用的过滤后的序列数，经过对过滤后的数据进行比对注释，获得12个已知miRNAs，未发现有新miRNA，其中sja-miR-3488表达量最高，sja-miR-36-3p和sja-miR-71a表达量也较高，这三种miRNAs表达量占91.8%。而血吸虫虫卵中sja-miR-71b-65p、sja-miR-71、sja-miR-1、sja-miR-36-3P、sja-miR-124-3p表达最高，占86%，说明特定miRNA家族在寄生虫的不同发育阶段都有特征性的偏倚表达[25]。sja-miR-36-3p在血吸虫胚胎发育中起重要作用，同时也可调节血吸虫尾蚴和肺期童虫发育；sja-miR-71家族成员在虫卵阶段发挥重要的调节作用[25]。

综上，通过对血吸虫ESP中miRNAs的鉴定，尤其是sja-miR-3488、sja-miR-36-3p和sja- miR-71a可能在血吸虫病虫卵致病过程中具有重要作用，它们是否存在于血吸虫感染宿主血清中，值得进一步验证和阐明其功能以寻找新的血吸虫病诊断标志物。