一例粪类圆线虫感染的形态学和分子生物学诊断

杨瑞冰 王立富 贺平 袁东亚

粪类圆线虫病是一种好发于热带及亚热带地区的被忽视的热带寄生虫病[1,2]，由粪类圆线虫(Strongyloidesstercoralis)和费氏类圆线虫(Strongyloidesfuelleborni)感染而引起，前者较为常见。据Zeno Bisoffi等2013年的保守估计，全世界超过3.7亿的人口被粪类圆线虫感染[3]。

人类感染粪类圆线虫后，可以表现为无症状感染、轻微的胃肠道症状、皮肤损害及伴或不伴发热的肺部损害[4，5]。长期感染可导致免疫力低下、接受糖皮质激素治疗和器官移植的患者发生致命的播散性超重度感染症状[6,7]。因此，在感染早期作出及时诊断与治疗，可根除感染以减少远期致命的并发症发生[3]。本文用形态学特征结合分子生物学的方法，确诊了一例粪类圆线虫感染病例现报告如下。

材料与方法

一、材料

粪便样本来源于一位在中山医学院寄生虫学教研室行寄生虫检查的患者；组织DNA小量提取试剂盒购自广州美基生物；2×Green master mix购自Promega公司；COX1和18S rRNA基因引物合成于广州擎科公司；EB染料购自北京普利莱基因技术有限公司；琼脂糖购自上海百晶生物科技有限公司。

二、方法

1.病情问询：对患者症状表现、生活饮食、是否有泥土接触史等情况进行问询。

2.显微镜下观察虫体形态特征：采用生理盐水涂片法对患者粪便样本进行涂片，显微镜下观察。

3.DNA提取及PCR检测：用组织DNA小量提取试剂盒按照说明书提取该虫体的DNA。采用PCR技术，用2×Green master mix(Promega,USA)和引物对COX1及18S rRNA基因进行扩增。COX1基因引物通过犬弓蛔虫、狮弓蛔虫、毛圆线虫属钩虫及人蛔虫的COX1序列设计得到。COX1基因的上游引物为5′-GTGGTTTTGGTAATTGAATGGTT-3′，下游引物为5′-ACCAGTTATACCACCTATAGTAA-3′。PCR的反应条件为：95℃变性5 min；95℃变性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸50 s，共35个循环；最后70℃延伸10 min。18S rRNA上游引物为5′-TCGTCCACCTTGGTGACTCT-3′，下游引物为5′-CTTCCGCGAACTCGGTGATA-3′。PCR扩增条件为95℃变性5 min；95℃变性50 s，52℃退火50 s，72℃延伸50 s,共35个循环；最后72℃延伸10 min。通过EB预染的1%的琼脂糖凝胶对COX1和18S rRNA PCR产物进行电泳。

4.PCR产物回收测序及比对：采用胶回收试剂盒对COX1和18S rRNA 的PCR产物进行回收，纯化回收的PCR产物送Invitrogen公司测序。COX1和18S rRNA 的序列结果通过Blast进行比对分析(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

结 果

一、病人情况

患者男，64岁，自述手痒、无力、手指疼痛2个月，于广东省第二人民医院就诊，入院行血常规、血压、脉搏、心率等常规及专项检查，诊断为类风湿性关节炎，服用抗风湿药物治疗。患者有泥土接触史，血常规结果显示嗜酸性粒细胞增高。

二、形态学检查

通过生理盐水涂片法在显微镜下对患者的粪便样品进行检测，发现疑似线虫游动。为进一步鉴定该幼虫，对粪便中虫体进行了清洗、富集，在显微镜下进一步检查，发现该虫体呈线性，半透明，尾部短，虫体一端较钝，一端尖细，见图1。该虫体的形态学特征与犬弓蛔虫、狮弓蛔虫、毛圆线虫属、钩虫及人蛔虫的幼虫十分相似。因此推断该虫为线虫属的一种，但是无法明确其具体物种。

A：×100；B：×400

图1显微镜下虫体形态

三、分子生物学检查

为进一步明确该虫体，采用PCR技术对该线虫COX1及18S rRNA基因进行扩增，PCR产物用EB预染的1%的琼脂糖凝胶电泳。结果提示该线虫为粪类圆线虫，见图2。

图2COX1和18S rRNA PCR产物电泳结果

为进一步验证PCR结果，我们对COX1和18S rRNA 的PCR产物进行回收，纯化后测序。测序序列通过Blast进行分析(http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。比对结果提示该虫体的COX1和18S rRNA序列与已发布的粪类圆线虫的序列相同(COX1 Sequence ID: KU962143.1; 18S rRNA Sequence ID: MH932096.1)，见图3。验证该虫体为粪类圆线虫。

图3COX1和18S rRNA序列Blast分析结果

讨 论

目前，粪类圆线虫病的确诊主要依据流行病学资料、病原学检查和血清学检查。重复多次的粪便涂片后形态学观察为主要方法，但是漏检率依旧很高，且粪类圆线虫幼虫与其他线虫的幼虫如犬弓蛔虫、狮弓蛔虫、毛圆线虫属、钩虫及人蛔虫的形态学特征相似，增加了诊断的难度，从而导致临床医生(尤其是年轻无经验的临床医生)误诊。而ELISA检测方法由于假阳性率较高，无法达到精确诊断的要求。寄生虫感染的分子生物学检测是指对寄生虫的基因和核酸进行诊断的技术，其特异性好、灵敏度高，快速准确，适用于各种寄生虫病的检测和诊断，成为了最具前景的诊断技术。

粪类圆线虫病临床表现复杂，虫体可在人体小肠繁殖，产生的丝状蚴可移行到中枢神经系统、肝脏等其他器官，引发自身重度感染。此外由于来自肠道的大量感染期幼虫在体内的移行，可将肠道的细菌带入血流而引起败血症[8]。分子生物学诊断方法通过对粪类圆线虫的鉴别基因进行扩增，并进一步测序比对，可以百分之百确诊，达到及早诊断、及早治疗的效果，尤其适用于免疫力低下、接受糖皮质激素治疗和器官移植后发生致命的播散性超重度感染症状的患者。本研究采用形态学特征观察结合分子生物学方法诊确诊了一例粪类圆线虫感染的病例，并及时提出了驱虫治疗方案。该患者在就诊后服用阿苯达唑，于一个月后复查，血常规结果显示嗜酸性粒细胞恢复正常，粪检结合PCR检测未发现粪类圆线虫感染，病情得到缓解，提示形态学特征结合分子生物学诊断方法可为临床寄生虫病的及时确诊提供重要保障。