结核分枝杆菌热休克蛋白HtpG基因的原核表达与鉴定

陈竹 王维斯 韦一鸣 王雪岩 任坤雨 胡琪 余才涛 李顺 吕樵岚 陈勇

结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的一种世界性传染病。卡介苗(BCG)接种仍是预防TB 的主要手段，但卡介苗对成人免疫保护效率具有一定的不确定性。近年来随着M.tb耐药株流行，以及HIV合并感染者增多等原因，使得全球抗痨形势日益严峻[1]。研究M.tb蛋白抗原的免疫学特性对于阐明结核病的致病机制，以及开发有效的新型疫苗和免疫学诊断试剂具有极其重要的意义。M.tb可大量合成表达多种热休克蛋白，已有研究表明，某些M.tb热休克蛋白(如HSP65、HSP70)本身既可发挥增强免疫应答的作用，又可保持分枝杆菌的特异性抗原特性[2,3]。M.tbRv2299c分子又称为HtpG，属于热休克蛋白HSP90家族的成员。最近Han-Gyu Choi等[4]发现M.tbHtpG蛋白可显著诱导人树突状细胞(DC细胞)活化。本研究对M.tbHtpG基因进行克隆，并在大肠埃希菌中进行表达，为进一步深入研究其免疫学特性，以及将其应用于结核病免疫诊断试剂的研制奠定基础。

材料与方法

一、材料

1.菌种、试剂和设备：M.tbH37Ra株购于中国生物制品检定所。pET22b质粒购于美国Novagen公司，大肠埃希菌DH5a和BL21(DE3)为本室保存。EcoR I和Hind III购于日本Takara公司，pfu DNA聚合酶购于上海生工公司。PCR产物纯化试剂盒购于美国Axygen公司。Ni-NTA亲和层析柱购于美国GE公司。HRP-羊抗人IgG购于武汉博士德公司。DAB底物试剂盒购于北京天根公司。25例肺结核患者血清，其中男18例，女7例，年龄16～65岁，平均(40.5±20.3)岁，所有患者均符合《肺结核诊断和治疗指南》的诊断标准，均具有细菌学或病理学诊断阳性证据[5]。25例正常健康者血清，其中男16例，女9例，年龄18～50岁，平均(35.2±10.5)岁,为影像学正常及近期无接触结核病史的正常体检者。

2.引物设计与合成：根据GeneBank网站公布的M.tb基因HtpG(Gene ID：887501)上下游序列而设计PCR引物。上游引物P1：5′-CCGGAATTCATGAACGCCCATGTCGAGCA-3′，内含EcoR I酶切位点(下划横线)；下游引物P2：5′-CCCAAGCTTCAAGGTACGCGCGAGACG-3′，内含Hind III酶切位点(下划横线)。上述引物均由上海生工生物工程公司合成。

二、方法

1.M.tbH37Ra基因组DNA的提取：将M.tbH37Ra菌株接种于苏通培养基中，于37℃静置培养3～4周，经4 000 r/min离心10 min收获菌体，参照文献[6]的方法提取M.tb基因组DNA。

2.HtpG基因的扩增：PCR扩增体系为 pfu DNA聚合酶 1μL，dNTPs 4 μL(2.5 mmol/L)，10×buffer 5μL，上、下游引物各1μL，模板DNA 1μL，加水至50μL。PCR扩增条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，63.9℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，循环30次，72℃延伸10 min。以1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用PCR产物纯化试剂盒提取目的片段。

3.重组表达质粒的构建及鉴定：将回收的PCR扩增产物和pET22b质粒分别采用EcoR I、Hind III双酶切消化，使用胶回收试剂盒回收相应的DNA片段，将回收的HtpG与pET22b在T4 DNA连接酶的作用下，16℃连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a。挑取单菌落进行纯培养，通过小量提取质粒进行PCR和酶切鉴定。同时对筛选到的阳性克隆子进行测序分析，测序由南京金斯瑞生物工程公司完成。

4.HtpG重组蛋白的诱导表达：将阳性克隆子转化大肠埃希菌BL21(DE3)，挑取构建好的工程菌单菌落接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜。次日按1∶100比例扩种，37℃摇床培养至A600nm值为0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续诱导6 h。SDS-PAGE电泳鉴定表达结果，考马斯亮蓝R-250染色。另外，调整工程菌的诱导时间和诱导剂浓度，以确定最佳的诱导条件。

5.HtpG重组蛋白的纯化：经4 000 r/min离心10 min，收集诱导后的菌体，菌体沉淀重悬于常规细菌裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，0.15 mmol/L NaCl，pH 8.0，临用前加入1 mmol/L PMSF)中，冰浴超声破碎，离心后分别收集上清和沉淀以备SDS-PAGE电泳分析。另外，将上清液上样镍亲和层析柱。上样后使用结合缓冲液洗涤，再依次使用洗脱缓冲液(分别含有80、100、250和500 mmol/L咪唑的结合缓冲液)梯度洗脱，收集各洗脱液样品，SDS-PAGE电泳鉴定。

6.纯化HtpG重组蛋白的Western blot分析：将纯化产物进行SDS-PAGE，并转膜至硝酸纤维素膜，封闭，依次加入肺结核患者血清及HRP-羊抗人IgG，DAB显色，观察结果。正常者血清为阴性对照。

7.ELISA检测肺结核患者血清抗HtpG特异性IgG抗体：取HtpG重组蛋白(20 mg/L)包被96孔酶标板，分别取25份肺结核患者血清和25份正常健康者血清按1∶50稀释，均做复孔，每孔100 μL，同时设空白对照孔。室温孵育1 h，洗涤5次，加入经1∶2 000稀释的HRP-羊抗人IgG 100 μL/孔，室温孵育1 h，洗涤5次，加入TMB底物显色10 min，加入终止液，酶标仪测定A450值。

结 果

一、HtpG基因的克隆与重组表达质粒的构建用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，约在1 944 bp处出现一条与HtpG基因预期大小相近的DNA条带(图1)。构建的重组表达质粒pET22b-HtpG经PCR扩增及EcoR I、Hind III的酶切消化，也均可检测到大小约为1 944 bp的DNA条带(图2)。另外，Blast同源性比对结果显示目的基因的测序结果与Genebank公布的M.tbHtpG基因序列完全一致。

M：DNA标志物；1：HtpG基因PCR产物

M：DNA标志物；1,2：重组质粒pET22b-HtpG pCR扩增产物；3：pET22b-HtpG经EcoRI单酶切；4：pET22b-HtpG经 EcoRI和Hind III双酶切

二、HtpG重组蛋白的诱导表达与纯化

工程菌经IPTG诱导后，在分子质量约73 kDa处出现明显的目的蛋白条带，同HtpG蛋白预期大小相符，未诱导的菌体则没有明显的表达条带。由于蛋白的表达水平跟诱导时间及诱导剂IPTG的浓度有关，本文分别对这两个影响蛋白表达的因素进行摸索，结果显示最佳诱导的条件为：6 h、0.1 mmol/L(图3)。

对HtpG重组蛋白的可溶性进行分析，表明其主要以可溶性形式存在于菌体裂解上清液中。裂解上清液经Ni-NTA亲和层析柱纯化，可见含有80、100、250 或500 mmol/L 咪唑的缓冲液均可洗脱HtpG重组蛋白，但以含有100 mmol/L咪唑的缓冲液洗脱纯化的HtpG重组蛋白纯度最高，经蛋白凝胶成像仪软件分析，该纯化HtpG重组蛋白的纯度达到91.6%(图4)。

M：蛋白标志物；1：诱导0h；2：诱导3 h；3：诱导4 h；4：诱导5h；5：诱导6 h；6：1.0 mM IPTG诱导；7：0.5 mM IPTG诱导；8：0.25mM IPTG诱导；9：0.1mM IPTG诱导

M：蛋白标志物；1：诱导0h；2：诱导6 h；3：菌体裂解上清液；4：菌体裂解沉淀；5：80 mM咪唑洗脱蛋白；6：100 mM咪唑洗脱蛋白；7：250 mM咪唑洗脱蛋白；8：500 mM咪唑洗脱蛋白

三、HtpG重组蛋白的Western blot分析

结果可见肺结核患者血清可以和HtpG重组蛋白发生特异性结合反应，在分子质量约73 kDa处形成一条特异性棕色条带，健康者血清则无此反应，表明HtpG重组蛋白具有良好的免疫反应性，但由于HtpG重组蛋白在提取过程中发生轻微降解，导致出现两条相近的条带(图5)。

M：蛋白标志物；1：肺结核患者血清；2：健康者血清

四、肺结核患者血清抗HtpG特异性IgG抗体的ELISA检测

结果可见肺结核患者血清中抗HtpG特异性IgG抗体的A450值为0.684±0.172，而正常健康血清中抗HtpG特异性IgG抗体的A450值为0.162±0.058，两组间差异具有统计学意义(P<0.01)。

讨 论

大量研究表明，机体抵抗M.tb感染主要通过细胞免疫应答所介导，近年来人们发现M.tb的某些热休克蛋白对机体发挥抗TB保护性免疫至关重要。热休克蛋白是一类进化高度保守的蛋白，在正常生理条件下其表达水平较低，但当生物细胞受到某些理化或生物因素刺激时，可诱导其表达量显著升高，故又称为应激蛋白[7]。Retzlaff等[8]报道M.tbHSP70蛋白可显著诱导小鼠巨噬细胞分泌IL-1、TNF-γ等细胞因子。Georgieva等[9]报道M.tbHsp65蛋白可刺激人DC细胞成熟和增强人DC细胞递呈抗原以激活T细胞，同时还可诱导人DC细胞分泌大量IFN- γ而诱导炎症反应。Bulut等[10]报道M.tbHSP65蛋白能结合并激活内皮细胞表面的TLR4分子，M.tbHSP70蛋白能结合并激活内皮细胞表面的TLR2分子，从而促进内皮细胞活化及分泌IL-6、IL-8等炎症细胞因子。Floto等[11]发现M.tbHSP70可直接结合DC细胞表面的CCR5分子，从而诱导DC细胞活化。M.tb热休克蛋白HtpG的基因全长1 944 bp，编码蛋白含有647个氨基酸残基，分子质量约为72.96 kDa[12～14]。HtpG蛋白在M.tb胞浆内主要发挥分子伴侣作用[15]，这与定位M.tb胞浆的HSP70、HSP65等热休克蛋白的生理作用相似，但HtpG蛋白是否对机体免疫系统具有免疫激活作用则尚不清楚。近期有学者报道M.tbHtpG蛋白可结合人DC细胞表面的TLR4分子而刺激人DC细胞成熟，并可明显促进人DC细胞上调表达MHC分子以及CD80、CD86等协同刺激分子，这表明HtpG蛋白虽然与M.tbHSP65蛋白的氨基酸序列不同，但两者均可通过共同的TLR4受体分子而介导其下游的信号转导途径。另外，HtpG蛋白还可显著促进人DC细胞分泌TNF-γ、IL - 6、IL-1和IL-12等调节T细胞活化的细胞因子[4]。本文也表明HtpG蛋白可显著刺激机体发生体液免疫应答，产生特异性的抗HtpG抗体。大肠杆菌原核表达系统具有相对简单，价格低廉，易于高水平表达等优点。据此，本文根据Genbank中M.tbHtpG的基因序列，采用PCR技术从M.tb克隆HtpG基因，成功构建PET22b-HtpG重组质粒，并在大肠埃希菌中有效表达。Western blot和ELISA鉴定均表明 HtpG重组蛋白具有良好的免疫反应性，从而为将其应用于结核免疫诊断试剂的研制奠定了实验基础。