改良SDS法提取书虱总RNA的效果评估

卢莹 黄文雨 黄梦蕊 王波 陈潜 刘啸 汪书然 孙恩涛

书虱(book lice)体长约1 mm，隶属于啮目、虱啮科，是一类广泛存在于多种储藏物中的害虫，呈世界性分布[1]。该属昆虫已知种类近110种，我国现已报道该属昆虫16种，其中最常见和最具经济意义的是嗜卷书虱[2]。书虱高质量RNA提取是进行下游分子生物学研究的关键环节，然而目前的RNA提取方法存在着完整性差、产率低、操作繁杂、试剂价格昂贵等问题，如异硫氰酸胍苯酚法[3]、酚-SDS法[4]、CTAB法[5]和试剂盒法等[6]难以提出高质量的RNA。本实验对传统SDS法[7]进行优化，并与传统SDS和TRIzol法的提取效果进行比较，以建立一种适用于书虱总RNA的提取方法。

材料和方法

一、书虱

书虱采集于学生宿舍、校园图书馆、面粉厂的脏面粉和户外地表的枯枝落叶。

二、主要试剂

TRIzol试剂盒(Invitrogen)、RT-PCR试剂盒(TIANGEN)、β-巯基乙醇(Solarbio)、SDS(Solarbio)、醋酸钾、水饱和酚(TIANGEN)、三氯甲烷、异丙醇、乙二醇丁醚、无水乙醇、2×Taq Master Mix(TIANGEN)。

三、三种方法提取书虱RNA效果比较

取300只书虱成虫随机分为三组，每组100只，分别采用改良SDS法、传统SDS法和TRIzol法进行书虱总RNA提取。3种方法各重复进行15次。

1.TRIzol法 参照TRIzol试剂盒说明方法进行。

2.传统SDS法 根据参考文献[8]中步骤方法进行。

3.改良SDS法

(1)配置实验试剂：①核酸萃取液Ⅰ：200μL DEPC水、500 μL水饱和酚、100 μL 10% SDS；②β-巯基乙醇；③核酸萃取液Ⅱ：水饱和酚/氯仿/异戊醇=125/24/1；④乙二醇丁醚；⑤75%乙醇

(2)实验步骤：① 取100只书虱样本于1.5 mL 离心管中，向其加入15 μL核酸萃取液Ⅰ和5 μL β-巯基乙醇；② 由于书虱个体较小，易于离心管中悬浮影响研磨效果，将RNase-Free枪头在酒精灯上烧软轻轻按压使管口闭合，直接于RNase-Free离心管中研磨，于冰盒上小心研磨直至研磨充分，再将180 μL核酸萃取液Ⅰ加入到RNase-Free离心管中，充分混匀得到匀浆液。室温孵育3 min；③ 向匀浆液中加入200 μL 2 mol/L KAc缓冲液，轻轻吹打混匀。根据KAc缓冲液的最适pH值探究试验得出最佳的pH值。室温孵育5 min；④ 4℃ 12000 r/min离心15 min；⑤ 取上层水相，加入等体积的核酸萃取液Ⅱ吹打混匀，振荡30 s后室温孵育5 min；⑥ 4℃ 12 000 r/min离心15 min；⑦ 取上层清夜，加入等体积的乙二醇丁醚，吹打混匀，-20℃静置40 min；⑧ 4℃ 12 000 r/min离心15 min；⑨ 吸取上清，保留沉淀，加入500 μL 75%乙醇洗涤沉淀；⑩ 去除乙醇，将沉淀室温自然晾干后加入20 μL RNase-Free水，充分溶解沉淀。

四、改良SDS法KAc缓冲液最适pH值

设计pH梯度试验：实验设计3.3～3.9不同pH值的KAc缓冲液，浓度均为2 mol/L。每个梯度书虱数量100只，根据实验结果确定最适的pH值。

五、改良SDS法书虱最低适宜数量

分别取1、10、20、30、50、100只书虱成虫，随机分为六组，采用改良SDS法进行实验。

六、RNA提取效果鉴定

1.RNA电泳检测：用1%的琼脂糖凝胶电泳(110 V、180 m A电泳35 min)跑胶，然后用紫外凝胶成像系统拍照观察以检测RNA的完整性。

2.RNA浓度与纯度测定：用核酸蛋白分析仪(Eppendorf Mastercycler nexus GSX1)测定RNA溶液的浓度和纯度，每组样品重复3次，求平均值。根据A260/A280、A260/A280比值结果做纯度分析。

3.RT-PCR扩增β-actin基因：参照RT-PCR试剂盒(TIANGEN)说明书合成cDNA模板并进行PCR反应。PCR 反应体系：cDNA模板1.0 μL；上游引物0.5 μL；下游引物0.5 μL；无酶水4.25 μL、6.25 μL 2×TaqMaster Mix。PCR反应条件：95℃预变性4 min；94℃变性30 s；56℃退火30 s；72℃延伸1 min，循环34次；72℃终末延伸10 min；4℃保存。引物参照文献[9]的β-actin基因引物序列：上游引物5′-ATGATGGGCTCAGCGATGTCC-3′；下游引物5′-CTCCATCTAAGCTGCAGTCATGAT-3′。基因片段长度为457 bp。

结 果

一、三种方法提取书虱总RNA比较

1.琼脂糖凝胶电泳分析

对改良SDS法、传统SDS法、和TRIzol法提取的RNA产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，如图1所示。改良SDS法提取的书虱RNA完整性较好，电泳结果显示28s rRNA、18s rRNA和5s rRNA条带完整，条带之间无明显弥散现象；而传统SDS法提取结果可见有明显的gDNA污染；TRIzol法提取书虱RNA未见28s rRNA条带。

2.RNA浓度与纯度分析

改良SDS法、传统SDS法、TRIzol法提取书虱总RNA的浓度值差异有统计学意义(F=17.874，P<0.001)。经SNK法每组互比，改良SDS法浓度较高，其次为TRIzol法，传统SDS法较低(表1)。

M：DNA marker；泳道1-3：改良SDS法、传统SDS法、TRIzol法

改良SDS法及传统SDS法提取RNA的A260/A280均在理想值范围1.8～2.0内，说明存在蛋白质污染；TRIzol法的A260/A280高于2.0。改良SDS法提取RNA 的A260/A230在理想值范围2.0～2.2内，说明该方法可去除脂类、多糖等成分。TRIzol 法的A260/A230低于2.0，说明存在有机物质等污染。

表1 三种方法提取书虱RNA的浓度和纯度

二、改良SDS法KAc缓冲液最适pH值

KAc缓冲液最适pH值探究实验结果表明：当pH值在3.5～3.8范围内，提取的RNA质量较高，无gDNA污染，无弥散带。最后根据书虱总RNA浓度和完整性(表2、图2)建议改良SDS法采用pH3.7的KAc缓冲液。

表2 不同pH值的KAc缓冲液提取的书虱总RNA浓度和纯度

M：DNA marker；泳道1～7 pH值：3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9

三、改良SDS法书虱最低适宜数量

改良SDS法提取书虱样本，当书虱的样本量低至30只时，琼脂糖凝胶电泳出现微弱条带(表3、图3)。

表3 不同书虱数量提取的总RNA浓度和纯度

M：DNA marker；泳道1-6书虱数量(只)：1、10、20、30、50、100

四、RT-PCR扩增β-actin基因

改良SDS法(pH=3.7，书虱数量为30只)提取的书虱RNA 经RT-PCR后扩增出的β-actin基因片段长度约457 bp，与预期结果一致，且条带单一整齐，没有拖带(图4)。

M:DNA marker

讨 论

随着Northern blot、RT-PCR、qPCR等[10]生物技术的发展，下游分子生物学实验广泛应用，实验成功的关键在于高质量 RNA 的获取。采用传统SDS法提取书虱的RNA中往往存在严重的gDNA污染[11]，本实验用pH值更低的KAc缓冲液代替传统方法中的酸性NaAc缓冲液，KAc缓冲液中的K+可与 SDS结合成不溶性PDS(十二烷基硫酸钾)沉淀，同时沉淀了绝大多数的gDNA及蛋白质[12]；水相pH值较低时，大量核酸会分配到酚相中；反之，水相pH值过高，gDNA会被抽提出来。降低KAc缓冲液的pH使偏酸性的KAc缓冲液可以创造酸性的水相环境，使部分核酸被酚抽提液吸附。同时，使gDNA在加入酚/氯仿离心分层时更易进入酚相，从而与RNA分离[13]。在提取书虱RNA过程中，RNA酶无处不在且状态不稳定，因此，防止RNA降解是成功提取RNA的前提。实验研磨过程中，将内源RNA酶抑制剂β-巯基乙醇与SDS联合使用可有效抑制内源性RNase及酚类氧化酶，防止RNA的降解，保证高质量RNA的提取[14]。另外，本实验还将传统方法中49∶1的酚/氯仿改为125∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇，避免因苯酚过量难以洗涤而造成RNA污染。用乙二醇丁醚代替异丙醇沉淀RNA，使所得RNA沉淀提取效果更佳[15]。