氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯检测方法研究进展

李荷丽 罗季阳 苗 虹 吴永宁 李 立

（1.中国检验检疫科学研究院 北京 100176；2.国家食品安全风险评估中心）

1 前言

氯丙醇和氯丙醇脂肪酸酯是近年来发现的在食品中广泛存在的一类污染物，它们引起的健康风险不容忽视。氯丙醇可以分为以下4种：3-氯-1,2-丙二醇（3-MCPD）、2-氯-1,3-丙二醇（2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-DCP）、2,3-二氯-1-丙醇（2,3-DCP），前2种属于单氯取代的化合物，后2种属于双氯取代的化合物，其化学结构详见图1。氯丙醇类物质常温下为液体，一般溶于水、苯、甘油乙醇、丙酮、四氯化碳、乙醚或互溶。用盐酸水解工艺生产的水解植物蛋白（HVP）中往往会形成3-氯-1,2-丙二醇和1,3-二氯-2-丙醇。3-MCPD可以作为二氯丙醇（1,3-DCP和2,3-DCP）的前体，在3-MCPD浓度达到一定数值时，会进一步形成1,3-DCP和2,3-DCP，故而检测出3-MCPD含量高的食品中常有可能伴有1,3-DCP和2,3-DCP。

图1 氯丙醇的化学结构

氯丙醇脂肪酸酯（即氯丙醇酯）是氯丙醇类物质与脂肪酸进行酯化反应所形成的化合物，其种类较多。根据氯原子位置的不同，氯丙醇酯可以分为单氯取代的氯丙醇酯（MCPD酯）和双氯取代的氯丙醇酯（DCP酯）。单氯丙醇脂肪酸酯（MCPD酯）中的羟基与脂肪酸缩合时个数不同，MCPD酯又分为MCPD单酯和MCPD双酯。由于结构的特殊性，3-MCPD单酯可进一步形成 SN1和 SN2 2种取代类型。氯丙醇酯理论上又可以分为7类化合物，包括单氯丙醇酯（包括单氯丙醇单酯3种和单氯丙醇双酯2种）及2种双氯丙醇酯。其结构与分类详见图2。

图2 氯丙醇酯的结构与分类

氯丙醇酯的生成与油脂的精炼过程直接相关。文献表明，3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯（3-MCPD酯）是目前食品中污染水平较高的氯丙醇酯。如3-MCPD酯在含有可食用油和盐的加工食品中含量较高，因为精炼植物油是3-MCPD酯的主要来源，如饼干、油脂、小吃和糕点。2-MCPD酯的污染水平相对来说比3-MCPD酯低。目前，关于1,3-DCP酯和2,3-DCP酯检测方法及污染水平的报道相对较少。

鉴于以上基本情况，系统地梳理食品中的氯丙醇和氯丙醇酯灵敏、便捷、准确、高效的分析检测方法具有重要意义。本文主要从国外通用的检测方法、国标检测方法和其他检测技术3个方面系统地介绍氯丙醇和氯丙醇酯的检测技术进展。

2 国内外氯丙醇的检测技术

氯丙醇类物质的检测多采用气相色谱-质谱法，但因氯丙醇的极性较大，沸点较高，相对分子质量较小，故需进行衍生后生成挥发性高的物质以提高其检测的灵敏度。

2.1 美国官方分析化学师协会（AOAC）方法

AOAC认可的氯丙醇检测方法，源于英国中央实验室制定的3-MCPD氘代稳定性同位素稀释技术结合气相色谱质谱（GC-MS）的检测方法，获得国际公认，被世界各国普遍采用。此方法在试样中加入3-MCPD-d5内标溶液，以硅藻土（ExtrelutTM20）为吸附剂，正己烷与乙醚混合溶剂（体积比为9∶1）为洗脱剂，HFBI作衍生化试剂，气相色谱质谱联用法进行定量分析，检测限为0.005 mg/kg。AOAC的方法适用于水解植物蛋白、汤、原料、酱油、麦芽提取物、香肠、鱼、奶酪、面粉、淀粉、谷物和面包中3-MCPD的测定。

2.2 中国国家标准方法

2017年6月23日开始实施的食品安全国家标准GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的测定》[1]代替了 GB/T 5009.191—2006《食品中氯丙醇含量的测定》、GB/T 18782—2002《调味品中 3-氯-1,2-丙二醇的测定》、SN/T 0548.1—2002《出口酱油中1,3-二氯-2-丙醇和2,3-二氯-1-丙醇的检验方法》。与旧法相比，新的标准第一法优化了样品前处理的步骤，具有较低的检测限和定量限；第二法增加D5-2-MCPD、D5-2,3-DCP作为内标物质，将净化步骤由手填的硅藻土层析柱净化改为硅藻土小柱净化；并删除了原标准的第3法。这2种方法分别适用于食品中3-氯-1,2-丙二醇含量的测定和食品中氯丙醇多组分含量的测定。

2.3 其他检测方法

根据氯丙醇及其衍生物的性质，一般采用气相色谱串联电子捕获检测器（ECD）或氢火焰离子化检测器（FID）进行检测。采用ECD测定时，一般用苯基硼酸、HFBI或三氟乙酸酐（Trifluoroacetic Anhydride，TFAA）进行氯丙醇的衍生。由于HFBI衍生物的电负性较强、检测时灵敏度较高，因此，ECD检测更常用。Van Bergen等[2]曾报道GC-EC的检测方法，氯丙醇的检测限为0.05～0.1 mg/kg。

毛细管电泳法等方法也有报道。刑晓平等[3]运用毛细管电泳法测定水解植物蛋白液中3-MCPD的检测限为0.22 mg/L。申中兰等[4]建立了快速高效的酱油中3-MCPD的固相萃取-气相色谱-串联质谱法测定方法，方法检出限为0.005 mg/kg。易青等[5]建立了在线凝胶渗透色谱-气相色谱-串联质谱（Online GPC-GC-MS/MS）测定方法，目标化合物包括3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP。样品中加入同位素内标后，经过净化除杂萃取，萃取液经浓缩后测定。此种方法并未进行衍生化，前处理过程相对简单。4种氯丙醇的检出限范围为0.002～0.005mg/kg，定量限为0.005～0.01 mg/kg。

3 国内外氯丙醇酯的检测技术

目前，氯丙醇酯检测主要有直接测定法和间接测定法2种。

间接法采用气相色谱质谱（GC-MS）法，原理是首先将样品中目标化合物在酸、碱或酶作用下水解转化为游离的氯丙醇，然后对氯丙醇进行衍生测定。此法测定的是氯丙醇酯的总含量，不能对氯丙醇酯单体的含量及种类进行表征。常用的衍生化试剂有酮类、硼酸类、三氟乙酸酐和七氟丁酰类等。其中，又以七氟丁酰化试剂（HFBI、HFBA）和硼酸类（苯基硼酸，Phenylboronic Acid，PBA或丁基硼酸，Butylboronic Acid，BBA）为最常用的衍生化试剂。七氟丁酰化试剂能同时与3-MCPD、2-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP发生衍生化反应，所以能同时测定样品中所有种类的氯丙醇酯。PBA只能衍生3-MCPD和2-MCPD，因而只能测定3-MCPD酯和2-MCPD酯，不能对1,3-DCP酯和2,3-DCP酯的实际污染状况进行监测。

而直接测定法则是直接测定一种或几种不同的氯丙醇酯，不需要进行衍生反应，大多采用液相色谱-质谱法（LC-MS）进行测定。因此，LC-MS的测定方法又可以称作直接测定法。受市场上流通标准品种类的影响，直接测定法只能测定某个或某几种氯丙醇酯，容易低估样品中氯丙醇酯的含量。

3.1 德国脂肪科学学会（DGF）和美国油脂化学学会（AOCS）方法

目前，大多数文献报道的检测方法均源自德国脂肪科学学会（DGF）油脂中氯丙醇酯测定的标准方法C-III 18（09）和（DGF）C-VI 18（10）。C-III 18（09）这一方法首先将样品中缩水甘油酯去除，然后将目标化合物水解除杂，之后衍生，最后进行测定。研究表明，在特定条件下酯键断裂过程中3-MCPD和缩水甘油可以相互转化。另外，此方法在采用PBA衍生后，GC-MS检测时灵敏度受到很大影响，故此法检测的特异性不强，不能准确地表征食品中氯丙醇酯的实际含量。 后续改进的（DGF）C-VI 18（10）测定氯丙醇酯的标准方法中，将氯丙醇酯在碱性条件下进行水解，生成氯丙醇，之后将氯丙醇与衍生剂PBA反应，再进行GC-MS检测，使测定结果偏大的问题得以改善。近年来，GC-MS的检测方法在前处理技术上也有所改进和发展。氯丙醇酯常见间接测定方法详见表1。

表1 氯丙醇酯的间接测定方法

美国油脂化学学会（AOCS）目前报道了3种测定氯丙醇酯的方法。Pinkston等[14]对植物油样品直接稀释并进样，用在电喷雾电离（Electrospray Ionization，ESI）模式下采用LC-MS/MS方法，测定了5种3-MCPD单酯和9种3-MCPD二酯，定量限分别为0.02～0.05 mg/kg、0.05～0.1 mg/kg，个别二酯类定量限较高，达到 0.5～1 mg/kg。 MacMahon等[15]建立了可食用油中的22种3-MCPD二酯的测定方法，样品采用硅胶柱进行净化后，采用大气压化学电离（APCI）源正离子模式，LC-MS/MS方法进行测定。Dubois等[16]建立了可食用油中的7种3-MCPD单酯和7种3-MCPD二酯的LC-TOFMS的测定方法，3-MCPD单酯采用固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）、C18 和硅胶柱的净化，3-MCPD二酯采用SPE和硅胶柱净化。Yamazaki K.等[17]采用LC-MS/MS直接测定了油脂中10类3-MCPD酯的含量，检出限为0.02～0.08 mg/kg。与气相色谱或气相质谱法不同，液相质谱法测定样品前处理过程简单，不需进行衍生化反应。但同时这种方法也有缺点，如前文所述，以液相质谱法所测定的只是某些氯丙醇酯含量，不能测得其总含量。鉴于此，以液相质谱法所测得的含量不适合进行食品中氯丙醇酯膳食暴露风险评估，但可用于氯丙醇酯的毒理学研究以及评价油脂质量。

3.2 中国国家标准方法

2017年6月23日开始实施的食品安全国家标准GB/T 5009.191—2016《食品中氯丙醇及其脂肪酸酯含量的测定》第三法改为“食品中氯丙醇脂肪酸酯含量的测定气相色谱-质谱法”，适用于食品中4种氯丙醇酯含量的测定，检出限为0.005～0.01mg/kg，定量限的范围为0.01～0.025 mg/kg，弥补了之前国家标准方法中没有氯丙醇酯检测方法的空白。

3.3 其他方法

随着近年来检测设备的普及，目前多采用气相色谱和液相色谱串联质谱检测技术进行氯丙醇酯的检测，基本未见GC法检测技术的报道。除了李荷丽等[18]建立了稳定性同位素稀释的超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定动物组织与生物体液中氯丙醇脂肪酸酯的方法之外，目前基于LC-MS技术的检测方法，样品基质几乎全部是植物油样品。使用液相色谱-飞行时间质量分析仪（LC-TOFMS）或高分辨Exactive Orbitrap质谱仪测定植物油中3-MCPD酯的直接检测方法也已有报道。前处理方法中MCPD单酯和二酯的分离也还仅仅限于使用制备的硅胶柱。与植物油样品“直接稀释和注入仪器”的方法”[19]相比，使用硅胶柱和C18固相萃取SPE柱净化分析3-MCPD单酯和二酯[20]能获得更低的基质干扰和检出限（LOD）。对单酯和二酯单独分析可以详细地提供单个酯类的信息，这对于了解不同MCPD酯的污染状况具有重要的意义。

氯丙醇酯易受到酸碱度、盐和添加物等因素的影响，故在液相色谱条件下离子化程度一般不高。钠离子的存在有利于化合物的电离，提高化合物的响应值，但很容易造成离子源和质谱仪的污染，对仪器设备的损害程度较高，需要频繁进行清洗。再者，氯丙醇酯种类繁多，在目前的液相色谱条件下的可能不能实现包括同分异构体（如SN1-3-MCPD-棕榈酸单酯、SN2-3-MCPD-棕榈酸单酯、2-MCPD-棕榈酸单酯等）在内的全部氯丙醇酯的分离，这也成为限制氯丙醇酯液相色谱-质谱联用（LC-MS）法发展的因素。目前，除了MacMahon报道分离了2对3-MCPD 单酯和2-MCPD单酯的同分异构体和3对3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分异构体和李荷丽等报道分离了2对3-MCPD二酯和2-MCPD二酯的同分异构体外，其他直接测定3-MCPD酯的方法均未实现3-MCPD酯和2-MCPD酯的分离。

4 结语

目前，中国食品中氯丙醇的检测方法研究较多，但氯丙醇酯特别是双氯取代的氯丙醇酯检测方法的研究还处于空白阶段，并且食品加工过程中对每个环节所产生氯丙醇及其酯类的快速监测手段还很有限。因此，开展食品中氯丙醇酯检测方法的探索研究，可为以后研究氯丙醇酯的形成机制、代谢途径、毒理学性质及企业改进加工工艺和条件等控制措施方面提供技术支持。