新疆产半夏的质量评价△

邢冰，董诚明，李询，李曼

河南中医药大学 药学院，河南 郑州 450046

半夏来源于天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎[1]，我国大部分地区均有分布，主产于四川、湖北、河南等省。半夏性温，味辛，有毒，归脾、胃、肺经，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结的功效。长期以来，由于生态环境的破坏，加之根腐病害严重，种植成本高，半夏野生资源日趋枯竭[2-3]。目前，半夏主产区的产量已经难以满足市场的需求，而地域广阔的新疆地区所产的半夏质量评价的优劣尚不清楚。单一指标不能体现半夏总体质量，故需对其进行综合品质评价。甘肃省西和县素称为“中国半夏之乡”，栽培面积大，全县1/3的耕地是半夏适宜种植区。本研究将新疆引种半夏与甘肃半夏的质量进行比较，为新疆地区半夏的种植提供依据。

1 材料

1.1 实验材料

实验材料为栽培半夏鲜品及加工品，在新疆、甘肃产地收集，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.) Breit.的干燥块茎。

1.2 仪器及试剂

Waters e2695 UV-Waters2489高效液相色谱仪(美国Waters公司)；ba410-upr荧光显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；FA2204N 型电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)；鸟苷对照品(四川维克奇生物科技有限公司)；乙腈、甲醇为色谱纯(英国 Thermo Fisher)；乙酸为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法

2.1 样品分级

参照《76 种药材商品规格标准》[4]，对新疆半夏加工品以大小、单品质量、密度、色泽为指标进行分级。

2.2 半夏加工品水分、总灰分测定

取半夏加工品，分级处理，参照《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)中水分测定法(通则0832第二法)测定半夏药材的水分，采用灰分测定法(通则2302)测定总灰分。

2.3 显微鉴别及针晶含量测定

2.4 浸出物、有机酸含量测定

取半夏鲜品，去皮，低温干燥，粉碎，另取分级后加工药材，粉碎。水溶性浸出物参照《中国药典》水溶性浸出物测定法(通则2201)项下的冷浸法测定，总有机酸含量参照电位滴定法(附录Ⅷ A)测定。为使提取充分完全，有研究表明，热浸法提取率高于冷浸法[6]。本实验再对热浸法使用的溶剂进行了方法学考察，最终采用浓度为50%的乙醇，参照水溶性浸出物测定法(通则2201)中的热浸出法进行醇溶性成分含量的测定。

2.5 鸟苷含量的HPLC测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱XAqua C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇∶0.1%乙酸(3∶97)为流动相；检测波长为254 nm；流速为1 mL min-1；柱温为室温；进样量10 μL。

2.5.2 对照品的制备 精密称取鸟苷对照品约0.80 mg，加水溶解，定容于25 mL容量瓶中，配制成每1 mL含鸟苷32 μg的对照品溶液。

2.5.3 供试品的制备 取半夏药材粉末(过四号筛)，精密称定1.0 g，置150 mL具塞锥形瓶中，加50 mL蒸馏水浸30 min，超声(240 W，45 kHz)提取40 min，放冷，蒸干，用10 mL水充分溶解，滤过，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.5.4 线性关系的考察 按照2.5.1项下色谱条件，将鸟苷对照品溶液稀释为3.2、6.4、9.6、12.8、16、19.2、22.4、25.6 μg mL-1，注入高效液相色谱仪，以不同浓度鸟苷为横坐标，以各成分的峰面积为纵坐标进行线性回归分析，在其范围内得回归方程：Y=26 963X-49 525，r=0.999 7，表明鸟苷在质量浓度3.2～25.6 μg mL-1与峰面积呈良好线性关系。

2.5.5 精密度试验 取供试品溶液1份，按2.5.1项下色谱条件连续进样6次，按照其色谱图峰面积计算RSD值，结果得6次进样的鸟苷峰面积的RSD值为1.92%，显示仪器精密度良好。

2.5.6 重复性试验 精密称定同一份样品，制备供试品溶液6份，每份1.0 g，每份供试品溶液按2.5.1项下色谱条件进样，计算RSD值为1.91%，说明本方法具有良好的重复性。

2.5.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在供试品溶液制备后 0、2、4、6、8、10、12 h 按2.5.1项下色谱条件进样检测。RSD为1.48%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.5.8 加样回收率 精密称取鸟苷对照品0.8 mg，置于25 mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。精密称取新疆半夏粉末1.0 g，平行9份，加入上述对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL各3份，按供试品溶液制备方法操作及上述色谱条件进行测定。计算平均回收率为99.76%，RSD为1.50%。

2.6 数据分析

数据经 Microsoft excel 2010整理后，采用DPS 9.0系统进行新复极差法分析。运用SPSS 18.0 统计软件进行相关性分析和主成分分析。

3 结果

3.1 样品分级

对新疆半夏加工品以大小、单品质量为指标进行分级，外观均呈圆球形、半圆球形，上端圆平，中心凹陷(茎痕)，周围有棕色点状根痕，下面钝圆，较平滑。质坚实。断面洁白或白色。粉质细腻。气微，味辛、麻舌而刺喉。无包壳、杂质、虫蛀、霉变。分级结果见表1。

表1 半夏样品分级结果

3.2 半夏加工品水分、总灰分含量测定

半夏加工品的水分、总灰分质量分数均不超过的14.0%、4.0%，符合《中国药典》标准。样品含量测定结果见表2。

表2 半夏加工品水分、总灰分测定结果 %

注：同一列中不同小写字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

3.3 显微鉴别及针晶含量测定

粉末为类白色，淀粉粒极多，单粒类球形或圆多角形，直径2～20 μm，多数10～15 μm，脐点短缝状、人字状或星状；复粒2～3粒多见，观察到单粒与复粒之比约为4∶1，草酸钙针晶较多，散在或成束存在于椭圆形粘液细胞中，长约82～104 μm，另观察到螺纹导管，长约14～22 μm(见图1)，与《中国药典》所述“淀粉粒甚多，直径2～20 μm，脐点裂缝状、人字状或星状；针晶长20～144 μm，螺纹导管直径10～24 μm”一致。

新疆半夏鲜品及加工品的针晶含量差异显著，且新疆半夏鲜品的针晶含量显著低于甘肃产地。与甘肃半夏加工品相比，新疆二级、三级加工品的针晶含量较低。实验结果见表3。

表3 半夏针晶含量测定结果

注：同一列中不同小写字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

3.4 半夏鲜品及加工品的浸出物、有机酸、鸟苷含量测定

实验测得半夏鲜品及加工品的浸出物质量分数不少于9.0%、有机酸质量分数不少于0.25%，均符合《中国药典》要求，且加工后新疆半夏药材的浸出物、有机酸含量均明显下降，鸟苷含量影响不显著(表4)。

注：图片放大400倍；A.淀粉粒；B.螺纹导管；C、D.草酸钙针晶。图1 新疆半夏药材粉末显微图

与甘肃半夏鲜品相比，新疆半夏的水溶性浸出物及有机酸含量较高。与甘肃半夏加工品相比，鸟苷含量差异不明显，但新疆半夏一级加工品的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有机酸含量均较高，二级加工品的醇溶性浸出物及有机酸含量较高，三级加工品的有机酸含量较高(表4)。

表4 半夏浸出物、有机酸、鸟苷含量测定结果 %

注：同一列中不同小写字母表示差异有统计学意义(P<0.05)。

3.5 相关性分析

对影响半夏品质的5个指标(针晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有机酸含量、鸟苷含量)进行相关性分析，结果见表5。鸟苷含量与水溶性浸出物、醇溶性浸出物、针晶含量之间差异有统计学意义。

表5 相关性分析结果

注：*P<0.05。

3.6 主成分分析

主成分分析是将多指标简化为少量综合指标的一种统计分析方法，用少数变量尽可能多地反映原来变量的信息。选取和半夏品质相关的5个活性成分：针晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有机酸含量、鸟苷含量，应用主成分分析法对半夏新品及加工品的综合品质进行排序，从而进行新疆半夏质量的初步评价。5项综合品质指标有不同的量纲和数量级，为了避免量纲和数量级的影响，对指标数据进行标准化处理，结果见表6。对半夏样品中5项活性成分含量指标标准化值进行主成分分析，用SPSS统计分析时提取2个主成分，结果见表7，特征值大于1的是前2个主成分PC1、PC2。对于主成分数量的确定要求满足降维同时又尽可能反应出更多变量地信息，常用累积方差贡献率(≥85%)来确定主成分的数量，本研究中前2个主成份累积贡献率为88.75%，适合此方法，可用来评价半夏的质量。结果表明PC1主要反映的是醇溶性浸出物、鸟苷、水溶性浸出物、针晶的含有量信息，PC2主要反映的是有机酸的含有量信息。因此，5个指标(针晶含量、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有机酸含量、鸟苷含量)均可作为评价半夏质量的主要依据，根据不同主成分特征值的方差贡献率得出综合评价指标F[7]。对F进行排序，其结果也是对半夏质量综合评价的结果，见表8。综合主成分F得分越高，样品质量越好，可见新疆半夏鲜品质量优于甘肃半夏鲜品，加工后新疆半夏质量下降。

表6 半夏各单项指标的标准化值 %

表7 各因子载荷矩阵、特征值、贡献率及累积贡献率

表8 主成分因子得分排序

注：F1为第一主成分得分；F2为第二主成分得分；F为主成分得分总分。

4 讨论

本研究建立评价半夏质量的方法，测得新疆半夏加工品的水分、灰分含量值均符合《中国药典》标准，鲜品及加工品的水溶性浸出物、有机酸含量也符合《中国药典》标准，质量合格。核苷类成分是半夏药材及饮片中很重要的有效成分，其中鸟苷含量较高，常作为评价半夏质量优劣的重要依据[8-10]。通过相关性分析，针晶含量与鸟苷含量之间、醇溶性浸出物与鸟苷含量之间均具有显著(P<0.05)相关性，且有研究发现，半夏水溶性成分有鸟苷、腺苷等，醇溶性成分中有生物碱等活性物质[11]；半夏草酸钙针晶的含量与其刺激性有关[5]。再结合主成分分析，结果显示针晶含量、醇溶性浸出物亦可作为评价半夏质量的指标。

与主产区甘肃相比，新疆半夏鲜品的醇溶性浸出物及鸟苷含量无明显差异，且水溶性浸出物与有机酸含量均较高，表明本评价体系下的新疆半夏鲜品质量较佳。比较加工品的质量，得出新疆一级加工品的鸟苷含量与甘肃加工品间无明显差异，且针晶、醇溶性浸出物、有机酸含量均较高；新疆二级加工品的针晶、醇溶性浸出物及鸟苷含量与甘肃加工品间无明显差异，且有机酸含量较高。同时，经主成分分析得出半夏质量的综合排序，新疆鲜品优于甘肃鲜品。

对分级后新疆半夏加工品的活性成分进行测定，其中，鸟苷含量无明显差异，但样品间针晶、浸出物及有机酸的含量差异明显，有研究表明，半夏中醇溶性及水溶性浸出物等均与半夏的药理作用关系密切[12]，总游离有机酸具有较强的止咳、祛痰、抗炎作用，体外有抑制肿瘤生长的作用[13]。实验测得一级半夏加工品的针晶、水溶性浸出物和醇溶性浸出物质量分数分别为1.889 1%、9.785 7%、10.603 2%，二级样品有机酸质量分数为0.407 4%，均明显较其他等级样品高，而三级样品的针晶、浸出物及有机酸含量较低，鸟苷含量较其他等级的差异并不明显，说明半夏样品块茎大小及质地等在一定程度上影响着化学成分的含量，且经主成分分析进一步得出新疆半夏加工品的质量不一。因此，在以后的实验分析研究中，应注意样品分级。

实验比较了新疆半夏鲜品及加工品的成分含量差异，发现加工后半夏药材的浸出物、有机酸含量均显著降低，鸟苷含量损失较少，测得加工后3个等级药材的水溶性浸出物、醇溶性浸出物、有机酸质量分数平均值分别为9.574 3%、10.308 8%、0.382 7%，相比鲜品下降9.11%、7.73%、7.41%，因此，应进一步研究合适的加工工艺，注意温度的控制，在产地加工工艺中减少主要成分的流失。

通过对所收集半夏样品的观察及查阅相关文献，比较新疆及其他不同产地栽培半夏的外观性状，发现新疆栽培半夏块茎类球形，且直径普遍较大，其形状大部分发生明显变化，子块茎比较多。因此，亟需一种评价栽培半夏内在品质差异的方法，以控制半夏的质量，推广规范化种植技术，保证临床用药的安全有效。