HPLC-ELSD测定肉苁蓉中甜菜碱 甘露醇 果糖 葡萄糖和蔗糖的含量△

石子仪，吴云，朱月美，崔海鸥，王敏，殷洪梅，姜勇，屠鹏飞*

1.北京大学 药学院 中医药现代研究中心，北京 100191；2.江苏康缘药业股份有限公司，江苏 连云港 222047；3.中药制药过程新技术国家重点实验室，江苏 连云港 222047；4.中药提取物精制新技术重点实验室，江苏 连云港 222047

中药肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma或管花肉苁蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight干燥带鳞叶的肉质茎。具有补肾阳，益精血，润肠通便等功效，多用于肾阳不足，精血亏虚，阳痿不孕，腰膝酸软，筋骨无力，肠燥便秘[1]。现代药理研究表明，肉苁蓉具有提高性功能、抗老年痴呆症和帕金森病、提高学习记忆能力、抗衰老、抗疲劳、保肝、通便等多方面的作用[2-3]。大量的研究证实，肉苁蓉中苯乙醇苷类成分具有明显的提高学习记忆能力、抗老年痴呆症和帕金森病等的作用[4-5]，寡糖类及多元醇类成分具有润肠通便的作用[6-8]。《中华人民共和国药典》仅对肉苁蓉中苯乙醇苷类成分松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量进行了测定，未对其润肠通便作用的有效成分进行测定，难以实现对肉苁蓉药材的全面质控。为了克服这一局限性，建立与肉苁蓉主要功能主治相关的多指标质量评价体系，本研究采用HPLC-ELSD[9-11]，建立了肉苁蓉药材中甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的定量分析方法，并对58批不同产地的荒漠肉苁蓉药材和10批新疆和田地区的管花肉苁蓉药材进行了检测，为今后肉苁蓉药材的全面质量控制与评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Sartorius电子天平BT 25 S、BS 124 S(北京赛多利斯天平有限公司)；Agilent 1100 高效液相色谱仪；ALLTECH 2000ES型蒸发光散射检测器(ELSD)；超声波清洗器 KQ 250型(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品：甜菜碱(批号：110894-201604，纯度：99.2%)、甘露醇(批号：10053-201304，纯度：99.0%)、D-果糖(批号：111504-201703，纯度：99.8%)、D-无水葡萄糖(批号：110833-201506，纯度：99.9%)、蔗糖(批号：111507-201303，纯度：99.8%)，均购自中国食品药品检定研究院。

荒漠肉苁蓉药材收集于内蒙古、新疆、甘肃等地，共计58批，由北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥带鳞叶的肉质茎，见表3。

管花肉苁蓉药材收集于新疆和田地区，共计10批，由北京大学药学院屠鹏飞教授鉴定为列当科植物管花肉苁蓉Cistanchetubulosa(Schenk)Wight的干燥带鳞叶的肉质茎，见表4。

1.3 试剂

乙腈为色谱纯(天津市彪仕奇科技发展有限公司)、甲醇为色谱纯(天津市赛孚世纪科技发展有限公司)，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为ShodexAshaipak NH2P-50 4E 聚合凝胶柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(77∶23)；流速为0.7 mL min-1；柱温为25 ℃；蒸发光散射检测器(ELSD)：漂移管温度为100 ℃，载气流速为3 L min-1。

2.2 对照品溶液的制备

取甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖各0.25 mg的混合溶液，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取肉苁蓉药材粉末(过四号筛)约1.0 g，精密称定，置100 mL棕色量瓶，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定质量，浸泡30 min，超声 (功率250 W，频率35 kHz)处理40 min，取出，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失质量，摇匀，静置。精密吸取上清液5 mL，置25 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.2 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 测定法

分别精密吸取对照品溶液5、10 μL，供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，按外标二点法对数方程计算。

2.5 系统适用性试验

按2.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5 μL，注入高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图1。供试品色谱图中呈现与对照品色谱峰保留时间一致的色谱峰，分离度良好，色谱条件可行。

注：A.对照品；B.49号肉苁蓉样品；1.甜菜碱(betaine)；2.果糖(fructose)；3.甘露醇(mannitol)；4.葡萄糖(glucose)；5.蔗糖(sucrose)。图1 对照品及49号肉苁蓉样品HPLC图

2.6 线性关系考察

取甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖对照品适量，精密称定，分别加水制成每1 mL含甜菜碱0.496 0 mg、甘露醇0.994 0 mg、果糖1.012 6 mg、葡萄糖1.088 2 mg、蔗糖0.992 2 mg的溶液，分别精密取甜菜碱0.099 2、0.248 0、0.4960、0.992 0、1.984 0、2.976 0 μg，甘露醇0.198 8、0.497 0、0.994 0、1.988 0、3.976 0、5.964 0 μg，果糖0.506 3、1.012 6、2.025 2、4.050 4、5.063 0、6.075 6 μg，葡萄糖0.217 6、0.544 1、1.088 2、2.176 4、4.352 8、6.529 2 μg，蔗糖0.198 4、0.496 1、0.992 2、1.984 4、3.968 8、5.953 2 μg，照2.1色谱条件进样检测，记录峰面积；再分别以各对照品进样量的对数值X(μg)为横坐标，峰面积的对数值Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.7 精密度试验

精密吸取供试品溶液(49号样品)，在上述色谱条件下，连续进样6次，测定各色谱峰的峰面积，计算其RSD值。结果甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖峰面积的RSD分别为0.84%、2.56%、1.27%、2.62%、1.52%，表明本研究所用仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取肉苁蓉样品(49号样品)6份，按2.3项下的方法制备供试品溶液，测定各色谱峰的峰面积，计算相应含量。结果甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均含量(n=6)分别为7.93%、7.27%、8.74%、2.75%、4.81%，RSD分别为2.83%、1.94%、0.97%、2.60%、1.40%，表明该方法的重复性良好。

2.9 稳定性试验

取供试品溶液(49号样品)，分别于配制后0、4、8、12、16、24 h进样测定，计算各色谱峰的RSD值。结果甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖的RSD分别为0.61%、1.92%、1.34%、2.83%、0.69%，表明该供试品溶液在24 h之内稳定性良好。

2.10 回收率试验

取已知含量的肉苁蓉样品(49号样品)6份，精密称定0.25 g，置50 mL棕色量瓶中，按1∶1浓度分别精密吸取混合对照品溶液25 mL(其中含甜菜碱0.790 0 mg mL-1，果糖0.723 6 mg mL-1，甘露醇0.881 2 mg mL-1，葡萄糖0.270 8 mg mL-1，蔗糖0.488 3 mg mL-1)加入样品中，照2.3项下方法制备供试品溶液。按上述色谱条件检测，计算其回收率，结果见表2，表明方法准确性良好。

表2 5个待测成分加样回收率测定结果(n=6)

2.11 样品测定

按照供试品溶液的制备方法和测定方法，对58批的荒漠肉苁蓉样品和10批管花肉苁蓉样品进行了测定，结果见表3、4，荒漠肉苁蓉各产地各成分含量取均值后绘制柱状图见图2。

表3 肉苁蓉样品5个成分含量测定结果(n=2) %

表4 管花肉苁蓉样品5个成分含量测定(n=2) %

注：—表示未检出。

图2 不同地荒漠肉苁蓉5个成分含量均值柱状分析图

3 讨论

3.1 指标成分的选择

肉苁蓉总寡糖为肉苁蓉通便的有效部位[8]，笔者通过LC-MS及对照品对照分析该部位化学成分，确定该部位主要由甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖5个成分组成，因此选择这5个成分作为肉苁蓉药材润肠通便指标成分，建立含量测定方法。

3.2 色谱柱的选择

甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖、蔗糖5个待测成分，极性比较大，在反相C18柱中不能保留，一般1～2 min即出峰，成分间无法分离，因此考察了适合于糖和多元醇分离的氨基柱Waters Bonoapar NH2(300 mm×4.6 mm,10 μm)和Phenomenex Bondclone 10 NH2(300 mm×3.9 mm,10 μm)，以及聚合物基质的氨基柱Prevail Carbohydrate ES(250 mm×4.6 mm，5 μm)、ShodexAshaipak NH2P-50 4E(250 mm×4.6 mm，5 μm)。结果表明，聚合物基质的氨基柱能够有效地对这5个成分分离。

3.3 检测器的选择

5个待测成分均无明显紫外吸收，无法直接使用紫外检测器进行含量测定，因此本文采用HPLC-ELSD建立了肉苁蓉糖醇类成分的定量分析方法，同时对ELSD检测器的漂移管温度、载气流量等进行了考察，结果表明，该方法灵敏度高、重复性好、准确度高，可用于肉苁蓉药材及其他含甜菜碱及糖醇类成分的药材的质量控制。

3.4 供试品溶液的制备方法的考察

分别对不同的提取溶剂包括水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等进行了比较，结果除70%甲醇及甲醇溶剂提取率略低外，其他溶剂无明显差异，因此直接选择《中华人民共和国药典》肉苁蓉“含量测定”项下50%甲醇作为溶剂，按照相关供试品溶液的制备方法进行制备，再稀释5倍量测定糖醇类成分。

3.5 不同基原样品的检测与分析

本研究共测定了58批荒漠肉苁蓉和10批管花肉苁蓉药材样品中5个成分的含量。58批荒漠肉苁蓉样品中甜菜碱、甘露醇、果糖、葡萄糖和蔗糖的质量分数分别在2.73%～17.65%、2.46%～16.34%、2.52%～22.74%、0.97%～14.06%、3.15%～27.16%；10批管花肉苁蓉样品中甘露醇、果糖和葡萄糖分别在1.00%～13.04%、2.98%～8.85%、1.09%～5.33%，未检出甜菜碱及蔗糖成分。各批次间药材成分含量差异均较大，且暂无规律可循，提示建立该含量测定标准控制药材质量的必要性。另外，利用该方法可有效区分2种肉苁蓉基原植物，即管花肉苁蓉不含有甜菜碱与蔗糖成分，而荒漠肉苁蓉中这两种成分含量较高。这也为分析2种肉苁蓉药材在质地、生境不同提供了依据。荒漠肉苁蓉药材与管花肉苁蓉药材比较，质地较软，当地被称为“软大芸”，而管花肉苁蓉被称为“柴大芸”，这是因为荒漠肉苁蓉中含有蔗糖成分(3.15%～27.16%)。荒漠肉苁蓉主要分布在内蒙古的阿拉善，而管花肉苁蓉主要分布在新疆的和田地区，气温较阿拉善地区高，而且在当地常采用滴灌进行灌溉，但一旦气温降低，管花肉苁蓉会发生严重的冻害，一方面和其含水量较高有一定关系，另外就和其所含成分有关。甜菜碱[12-13]是一种重要的渗透调节物质，对于植物的抗逆性增强起着重要的作用，比如抗盐碱、抗干旱、耐低温、抗强光。正是因为荒漠肉苁蓉中含有了高含量的甜菜碱，使其比管花肉苁蓉表现出更好的耐盐碱、干旱和冻害的特性，而有了相对广泛的分布。

3.6 不同产地荒漠肉苁蓉样品分析

58批荒漠肉苁蓉药材样品中，产自内蒙古阿拉善盟的有45批，内蒙古王爷地(磴口县)的有3批，具体产地未知1批，全部49批药材中5个成分含量各异，但无明显差异，分析原因可能是药材均产自同一片沙漠区域范围，生态与地理环境相近，产品质量较均一、稳定。产自甘肃民勤县有3批、产自新疆的有6批，根据图2分析可知，与内蒙古产的药材比较，主要差异体现在果糖与蔗糖含量上，甘肃产药材果糖含量相对最高，新疆产药材蔗糖含量相对最高，但鉴于2个产地的样品量低，该结论有待于收集更多样品进行验证。

3.7 小结

本研究建立了同时测定5种润肠通便的活性成分的HPLC-ELSD，为肉苁蓉药材的质量控制提供了更加便捷、高效、准确的方法，为提升肉苁蓉药材的质量标准及进一步的开发提供了有意义的参考。