江枳壳HPLC指纹图谱及标志性成分含量测定研究△

孔庆国，张凯月，张晔，吕金朋，丁成健，李志成，张辉*

1.吉林省医疗器械检验所，吉林 长春 130062；2.长春中医药大学，吉林 长春 130117

枳壳是芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种的干燥未成熟果实。枳壳性苦、辛、酸，温，具有理气宽中、行滞消胀的功效[1]，主治胸胁气滞、胀满疼痛、食积不化、痰饮内停、胃下垂、脱肛、子宫脱垂等病症。目前枳壳在我国长江流域及其以南各省区均有栽培[2]，主要产地有江苏、浙江、江西、台湾、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等省份，形成了多种来源的中药枳壳商品药材[3]，但同时也造成了临床用药混乱的局面。枳壳以湖南和江西的产品为佳。其中江西省新干的枳壳又名商州枳壳、三湖枳壳，具有“果肉厚，外翻如覆盆，瓤瓣数较多”的特点，其药用的有效成分优于其他品种[4]，简称江枳壳。江枳壳中有大量的挥发油，目前已能进行含量测定的挥发油有50多种，主要有效成分为柠檬烯、蒎烯、蒎烯芳樟醇等，另外，还含有黄酮及生物碱类成分，主要的黄酮类成分有柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、川陈皮素、红橘素等。主要的生物碱成分有辛弗林(synephrine)、酪胺(tyramine)、N-甲基酪胺(N-methytyramine)、喹诺林(qinoline)等[5]。本研究对不同批次江枳壳的指纹图谱进行比较并结合测定有效成分含量为江枳壳的质量控制提供了量化数据，同时为江枳壳的规范化种植提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

800A型多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)；BS110S型电子天平(美国双杰兄弟有限公司)；1100型Agilent高效液相色谱仪(美国Aglient仪器公司)；KQ3200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WP-UP-10型精密型实验室专用超纯水机(上海捷惠科学仪器有限公司)；LXJ-IIB型低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试药

枳壳标准药材(批号：120981-201104)、芸香柚皮苷(批号：110721-201316)、柚皮苷(批号：111857-201102)、橙皮苷(批号：110722-201312)、新橙皮苷对照品(批号：10736-200628)购于中国食品药品检定研究院；甲醇(分析纯，北京化工厂)；甲酸(色谱纯，ANAQUA Chemicals)；乙腈(色谱纯，Fisher Chemicals)；水为娃哈哈纯净水。枳壳采自江西九江，共10批次，经长春中医药大学张辉教授鉴定为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.的干燥未成熟果实。

1.3 结果分析软件

中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版功能：通过导入相关液相色谱图，使用设参照谱、多点校正、自动匹配[8]、生成对照等功能对需要的色谱图进行比对分析，可以得到这一批色谱图的相似度等信息。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

取枳壳药材，粉碎，精密称取1.0 g，置100 mL具塞锥形瓶中，选择加甲醇30 mL，密塞，超声处理30 min，取出放冷，用滤纸滤过，药渣连同滤纸放回锥形瓶中再加甲醇30 mL，超声处理30 min，放冷，用滤纸滤过[9]，合并两次滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，既得。

2.2 对照品溶液的制备

取芸香柚皮苷、柚皮苷，橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1 mL各含80 μg的溶液，即得。

2.3 色谱条件

色谱柱：kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温：35 ℃；检测波长为254 nm；流速为0.8 mL min-1。以乙腈为流动相A，以0.1%的甲酸溶液为流动相B按程序梯度洗脱(0～10 min，0%～5%A；10～15 min，5%～15%A；15～40 min，15%～35%A；40～70 min，35%～55%)；进样10 μL。色谱图见图1～3。

注：3.芸香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。图1 江枳壳HPLC图

注：3.芸香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷。图2 枳壳对照药材HPLC图

注：1.芸香柚皮苷；2.橙皮苷；3.新橙皮苷；4.柚皮苷。图3 对照品HPLC图

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 任意选取一个按照2.2下方法制备的对照品溶液，按2.3项下方法连续进样5次。相对保留时间的RSD为0.086%～0.808%，相对峰面积的RSD为1.901%～2.741%，表明方法的精密度良好。

2.4.2 重复性试验 按照2.1下方法制备同一供试品溶液5份，按2.3下的液相条件进样，相对保留时间的RSD值为0.097%～1.991%，相对峰面积的RSD值为0.777%～2.866%，表明方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 按照2.1下方法制备供试品溶液，按2.3下色谱条件分别于第0、4、12、24、48 h进样，相对保留时间的RSD值为0.001%～0.011%，相对峰面积的RSD值为2.558%～2.928%，说明样品至少在48 h内稳定。

2.5 指纹图谱的建立

利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2004A)对11批枳壳药材(S1～S10为江枳壳药材，S11为枳壳对照药材)共计11批样品的高效液相色谱图进行分析比较[10]，以探究其呈现的具有“指纹”意义的共有峰的相对保留时间、相对保留峰面积、相似度等数据。指纹图谱的建立是为江枳壳的质量控制提供科学依据。在11批枳壳样品的高效液相色谱图的基础上[11]，通过中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版的软件，可建立该样品的高效液相色谱指纹图谱。

注：3.芸香柚皮苷；4.橙皮苷；5.新橙皮苷；6.柚皮苷；S1～S10.江枳壳；S11.枳壳对照药材；R.对照谱图。图4 11批枳壳的高效液相色谱指纹图谱(λ=254 nm)

2.6 枳壳的高效液相色谱图分析

枳壳的高效液相色谱可分离出10余个成分。经中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版软件的对比，从中选取8个具有“指纹”意义和稳定的共有峰。见表1。

2.7 共有峰的相对保留时间及相对峰面积

通过与对照品保留时间进行比较，峰3为芸香柚皮，峰4为橙皮苷，峰5为新橙皮苷，峰6为柚皮苷。橙皮苷在本实验条件下实现了最佳的吸收度和较好的分离度，峰位居中，相对面积稳定，故将橙皮苷色谱峰定为参照峰。计算各共有峰的相对保留时间及相对保留峰面积，见表2～3。

表1 11批枳壳8个共有峰峰面积

表2 11批枳壳的8个共有峰的相对峰面积

表3 11批枳壳的8个共有峰的相对保留时间

2.8 指纹图谱相似度计算

参照“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版”软件计算得到11批枳壳样品的高效液相色谱指纹图谱的相似度[12-16]，见表4。

表4 11批枳壳的相似度

从表4可以看出，本实验中11批枳壳样品的高效液相指纹图谱的相似度均在0.900以上，可初步判定这11批枳壳样品的高效液相指纹图谱相似。

2.9 枳壳中橙皮苷及柚皮苷的含量测定

2.9.1 线性关系考察 以2.2项下方法制成对照品溶液，分别吸取2、4、6、8、10 μL进样，按2.3色谱条件测定。以峰面积为Y轴，进行线性回归分析，得到橙皮苷回归方程：Y=776.13X+119.27(r=0.999 7)，橙皮苷线性范围0.479～2.395 μg，柚皮苷回归方程Y=840.91X+98.98(r=0.999 2)，柚皮苷线性范围0.500 4～2.394 μg。

2.9.2 精密度试验 分别精密吸取混合对照品溶液10 μL，在2.3项色谱条件下重复进样5次，计算橙皮苷、柚皮苷的峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

2.9.3 稳定性试验 精密吸取同一个按照2.1方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、12、18、24 h进样。结果显示，各色谱峰面积的RSD均小于2.0%。

2.9.4 重复性试验 精密吸取同一个按照2.1方法制备供试品溶液，在2.3项色谱条件下重复进样5次，各色谱峰的峰面积RSD均小于2.0%，表明方法的重复性良好。

2.9.5 加样回收试验 取已知含量的枳壳样品约1 g，平行6份，精密称定分别加入对照品适量，按2.1方法制备供试品溶液，按2.3项色谱条件下进行分析，计算橙皮苷、柚皮苷的平均加样回收率分别为98.95%、99.67%。

2.9.6 样品含量测定 按照2.1方法制备11批供试品溶液，按2.3项色谱条件下分别测定橙皮苷、柚皮苷的的含量，含量测定结果见表5。

表5 江枳壳样品中橙皮苷与柚皮苷含量测定 %

3 结论

枳壳的有效成分因其产地、气候、采收时间、加工方法及品种不同有很大的差异[17-20]。本实验利用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”对11批枳壳药材建立HPLC指纹图谱，结果表明11批枳壳样品具有比较好的重复性和稳定性，相似度均在90%以上，符合《中华人民共和国药典》要求。同时测定了11批枳壳样品中橙皮苷和柚皮苷的含量，结果显示不同样品中两种成分的含量差异不大。实验结果表明，江西九江的10批江枳壳药材无明显差异。通过对指纹图谱的相似度分析，结合主要成分的含量测定结果，发现这种联合的方法特征性及专属性强，是枳壳质量控制的一种有效、合理的方法，也可为其他传统中药的质量评价提供参考。