HPLC测定女贞子中特女贞苷的含量及指纹图谱的建立△

刘美，张娟，肖炯昌，刘红娜，曹兆军，李先宽，马琳*

1.天津中医药大学，天津 300193；2.清华德人西安幸福制药有限公司，陕西 西安 710043

女贞子为传统的固本扶正常用中药，始载于《神农本草经》，列为上品，名女贞实[1]，在2015版《中华人民共和国药典》收录为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实。味甘、苦，凉，归肝、肾经，有滋补肝肾，明目乌发的功能。常用于治疗肝肾阴虚，眩晕耳鸣，腰膝酸软，须发早白，目暗不明，内热消渴，骨蒸潮热等症状[2]。女贞子主要含有以下化学成分：1)三萜类化合物，包括乌苏烷型、齐墩果烷型、达玛烷型以及羽扇豆烷型4种，共有熊果酸、齐墩果酸等40余种化合物[3]，谭文广等[4]采用紫外法测定超声提取得到的三萜化合物质量分数为5.61%，2005版《中华人民共和国药典》前曾将齐墩果酸作为女贞子含量测定的指标成分；2)黄酮类化合物，其主要为木犀草素、芹菜素、槲皮素及其糖苷共7个化合物[5]；3)环烯醚萜类的化合物主要有2个，即环烯醚萜与裂环环烯醚萜，主要为女贞苷、特女贞苷、新女贞子苷等[6]，特女贞苷为2015版《中华人民共和国药典》质量控制的含量测定指标成分；4)苯乙醇苷类化合物，包括毛蕊花苷、对羟基苯乙醇、北升麻宁等[7]；5)其他成分，包括各种微量元素如K、Ca、Na、Mg、Zn、Fe等，17种水解氨基酸，以及多糖、挥发油、甘露醇、磷脂、脂肪酸等多种成分[8]。此外，女贞子具有保肝、免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗癌、降血糖、降血脂、抗炎抑菌、保护损伤细胞、强心等多种药理作用[8]。

女贞子资源丰富，且为常绿植物，在我国广泛栽种，野生家种均有，主要分布于河北、河南、江苏、安徽、陕西、甘肃等地。但走访药材市场发现目前市售的女贞子药材质量较为混乱，混伪品和杂质较多，使得整个行业女贞子质量下降，且存在不均一性，因此对于市售女贞子药材的质量进行严格管控，才能提高女贞子行业的质量标准。目前关于女贞子的研究较多，本研究主要采用高效液相色谱法测定安徽、河南、江苏及陕西4个产地共23批女贞子药材中特女贞苷的含量，并建立23批女贞子药材的指纹图谱，从而为完善和提高女贞子药材的行业质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，配SPD-20A紫外-可见光检测器，二元泵，在线脱气机，SIL-20A自动进样器，柱温箱，LC solution工作站；Sartorius BT125D电子天平(赛多利斯科学仪器北京有限公司)，FA2004电子天平(上海精天电子仪器有限公司)，DFT-200 手提式高速中药粉碎机(温岭市林大机械有限公司)，TDZ4-WS低速台式离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)，KH3200B型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂及药材

特女贞苷(天津万象恒远科技有限公司，纯度>98%，批号：20171005)。乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。

23批女贞子药材经天津中医药大学马琳教授鉴定均为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果实。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.1%磷酸水-乙腈梯度洗脱60 min，梯度洗脱程序为：0～5 min，10%～10%乙腈；5～20 min，10%～20%乙腈；20～50 min，20%～33%乙腈；50～55 min，33%～100%乙腈；55～60 min，100%～100%乙腈。检测波长为224 nm；柱温25 ℃；进样量20 μL，体积流量1.0 mL min-1。

2.2 溶液的配制

2.2.1对照品溶液的制备 精密称取特女贞苷对照品6.52 mg，置10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇溶解定容，制成0.652 mg mL-1的特女贞苷对照品溶液，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 精密称取女贞子药材粉末(过三号筛)约1.0 g，置50 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇水30 mL，称定质量，超声提取30 min，取出，放至室温，再称定质量，用70%甲醇水补足减失的质量，摇匀，离心10 min(4000 r min-1)，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取2.2.1中特女贞苷对照品溶液适量，稀释成不同系列浓度的对照品溶液，分别进样20 μL，记录特女贞苷峰面积，以浓度X为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=19.7X+0.242 6 (r=0.999 6)，结果表明特女贞苷在0.054 33～0.652 mg mL-1线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取特女贞苷对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录特女贞苷峰面积，计算RSD(n=6)值为0.52%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密吸取同一批女贞子供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样分析，记录特女贞苷峰面积，计算RSD(n=7)值为1.04%，表明女贞子供试品在室温条件下放置24 h 稳定性良好。

2.6 重复性试验

准确称取同一批女贞子样品共6份，按2.2.2项下方法平行操作，制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录特女贞苷峰面积，计算RSD(n=6)为1.22%，表明该方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验

准确称取同一批已知含量的女贞子样品共6份，每份0.5 g，分别加入特女贞苷对照品适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录特女贞苷峰面积，计算回收率得特女贞苷的平均加样回收率为101.17%，RSD为2.82%，结果表明该方法有良好的准确性。

2.8 样品含量测定

精密吸取23批女贞子样品的供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，连续平行测定3次，每次进样20 μL。所得特女贞苷对照品和女贞子样品色谱图见图1，含量测定结果见表1。

注：A.特女贞苷对照品；B.女贞子样品；1.特女贞苷。图1 女贞子对照品及样品HPLC图

表1 23批女贞子样品特女贞苷含量测定结果(n=3)

2.9 指纹图谱研究

将23批女贞子样品的色谱图，通过AIA格式导出文件，导入国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件。采用中位数法，设置参照图谱，进行多点校正，Mark峰匹配，生成对照指纹图谱，共指认了15个共有峰作为女贞子的基本特征峰，其中特女贞苷峰为10号峰，23批女贞子样品的HPLC指纹图谱见图2，将女贞子对照图谱与药材指纹图谱进行匹配，并计算相似度，得出非共有峰面积占比见表2，共有峰峰面积RSD见表3，相似度计算结果见表4。

注：10.特女贞苷峰；R.对照图谱。图2 23批女贞子样品HPLC指纹图谱

表4 女贞子指纹图谱相似度计算结果

续表4

3 结论与讨论

本实验过程中考察了不同的流动相体系：乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液等，结果发现乙腈-0.1%甲酸水溶液的峰形会产生拖尾现象，乙腈-水的色谱峰分离度较差，乙腈-0.1%磷酸水溶液能使各成分分离良好。故采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相，并对洗脱程序进行优化，最终建立简便可行的分析方法。

由含量测定结果可知，N07样品的特女贞苷质量分数仅为0.35%，其余22批样品的质量分数均达到了药典0.70%的要求，为0.35%～3.74%，其中安徽产地的女贞子药材中特女贞苷含量最高，比《中华人民共和国药典》规定的含量高达5倍多，可见安徽、河南、江苏及陕西4个产地的女贞子中特女贞苷含量均比较高。崔蕴慧等[9]采用高效液相色谱法测定湖北、广东、江苏、河南、广西、云南、江西、安徽、甘肃、陕西、浙江、湖南12个不同产地的女贞子中特女贞苷的质量分数为0.473%～2.149%，其中安徽产地为最高。张炯怡等[10]采用HPLC测定10批贵州女贞子中特女贞苷的质量分数为0.60%～1.02%。任爽等[11]采用高效液相色谱法测定了不同来源的16批女贞子中特女贞苷的质量分数为0.11%～2.77%。且笔者在安徽亳州药材市场采购样品时发现，当地的女贞子作为绿化植物栽种，资源十分丰富，但走访药材市场却发现市售的女贞子药材中当地产的并不多见，因此建议对当地的女贞子药材资源进行充分开发与利用。

其次，陕西的16批女贞子中特女贞苷的含量最稳定，为0.8%～2.2%；河南的女贞子中特女贞苷的含量相对江苏的较稳定，两个产地的3批女贞子药材特女贞苷的含量分别为高中低3个等级，且每个等级之间总体相差约为2倍，含量差异相对较大，田志祥等[12]通过研究女贞子10、11、12月份中特女贞苷含量变化，得出女贞子在11月份时的特女贞苷含量最高，10月份含量最低，可能与女贞子果实在10月份并未完全成熟有关，而在12月后，特女贞苷的光不稳定性造成其含量下降，或女贞子在生长过程中可能由红景天苷转化为特女贞苷[13]，故初步推测女贞子虽为同一产地，但有采收时间不同而造成含量有较大差异的可能，因此，严格把控女贞子等果实种子类药材的产地采收加工环节对药材行业质量标准统一性和均一性的建立有重要意义。

本实验通过高效液相色谱法建立了女贞子指纹图谱，比较了23批女贞子包括安徽、河南、江苏及陕西4个产地的指纹图谱，由表4可知除女贞子N07与对照指纹图谱的相似度低于0.8外，其余22批女贞子与对照指纹图谱均达到0.8以上。由表2 可知23批女贞子非共有峰面积占比为24.84%～60.42%，由表3可知其共有峰峰面积RSD在10.23%～96.54%，说明23批女贞子药材成分相似，但各共有成分之间相对差异较大，推测女贞子药材质量差异较大可能与生长环境、产地、采收期[9]、加工方法、贮藏时间及杂质含量不符合药典规范等因素有关，因此，对于女贞子药材的质量标准控制还需从源头把控。而且女贞子化学成分复杂，主要成分特女贞苷、女贞子苷、红景天苷、熊果酸、齐墩果酸等的研究越来越多，《中华人民共和国药典》仅以特女贞苷1个成分作为其含量测定的指标较为片面[14]，其他成分对于女贞子的质量标准制定也有影响，因此指纹图谱的建立完善对女贞子行业质量标准的控制可提供依据参考和意义。此外，女贞子质量控制的标准研究还有很多需要去深入研究，例如女贞子药效物质基础[15]、生物标志物等方面，从而综合建立更科学、有效、准确的行业质量控制标准。本实验的方法条件下，可测定女贞子中特女贞苷含量并同时建立女贞子药材指纹图谱，方法简单易行，为女贞子的行业质量标准的建立和提高提供了参考。