LC-MS/MS测定大鼠血浆中烟花苷浓度及其药代动力学和生物利用度△

贾田芊，田曼，翟思成，任丽，孙静*

1.陕西科技大学 镐京学院，陕西 咸阳 712046；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046

黄花油点草来源于百合科Liliaceae植物黄花油点草Tricyrtismaculate的干燥全草，具有安神除烦、活血消肿之功效，用药历史悠久，疗效突出，是跌打损伤重要品种之一。该药材蕴藏量较大，主要分布在陕西、四川、贵州等地海拔2300～2800米的山坡上。该植物是陕西重要的道地药材，广泛分布在秦岭地区。近年来，黄花油点草引起了研究者广泛关注。现代研究结果表明，黄花油点草中黄酮类[1-4]成分在小鼠微循环、鼠血栓、急性脑梗阻具有很强的药效。烟花苷[5-7](结构如图1，nicotiflorin)是黄花油点草主要成分之一，是一种连接有芸香糖的黄酮醇苷类水溶性化合物，存在于多种植物当中，现代药理研究表明[8-10]其具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛及神经保护等多种生物活性，并有较强的活血作用。

由于药用植物属于当地的传统品种，基础研究较少，目前未有关于烟花苷体内过程的报道。本实验参考文献[11-14]并不断探索，以柚皮苷为内标，建立了烟花苷的血浆药物浓度LC-MS/MS测定方法并测定了烟花苷在大鼠体内的药代动力学和生物利用度，为进一步提高烟花苷生物利用度及其临床联合治疗提供了科学依据。

图1 烟花苷结构图

1 材料

1.1 仪器

岛津Nexera XR LC-20AD高效液相色谱仪(日本SHIMADZU)，AB SCIEX QTRAP4500型质谱仪(美国AB SCIEX公司)，KH-400KDE高功率数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)，MS205DU十万分之一电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，EYELA MG-2200氮吹仪(上海赛默生物科技发展有限公司)，Allegra64R冷冻离心机(美国贝克曼库尔特有限公司)，SK-2涡旋振荡器(上海奥然科贸有限公司)。

1.2 试剂与动物

烟花苷(批号：100080-201610，纯度：91.9%)、柚皮苷(批号：K21F3C1，纯度：98%)均来自上海源叶生物有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯(天津医药化学技术有限公司)，磷酸为分析纯(南通天昊化工有限公司)，水为娃哈哈纯净水。

雄性SD大鼠，SPF级，体质量(200±20) g，[成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2015-030]。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm，1.9 μm，5 μL)；流动相为乙腈(B)-0.1%磷酸(A)；梯度为0～10 min，15%～25%B，10～12 min，25%～15%B；柱温 40 ℃；体积流量0.3 mL min-1；进样量 5 μL。

2.2 质谱条件

离子源采用电喷雾电离(ESI)源，检测方式：正离子检测。采用多反应监测(MRM)方式进行扫描；离子化电压(IonSpray Voltage)：-4500 V，气帘气(CUR)：241.325 kPa，离子源温度(TEM)：550 ℃，喷撞气(CAD)：Medium，喷雾器(Ion Source Gas 1)：344.75 kPa，辅助加热(Ion Source Gas 2)：344.75 kPa。烟花苷和内标的离子对及质谱见表1。

表1 烟花苷及内标质谱条件

2.3 对照品溶液的制备

精密称定烟花苷、柚皮苷适量，用甲醇溶解并配制成质量浓度为1 mg mL-1烟花苷和1 mg mL-1柚皮苷储备液，于4 ℃冰箱中保存待用，临用时稀释配制。

2.4 灌胃和尾静脉方式给药

大鼠适应性饲养一周，实验前禁食不禁水12 h，实验每组平行6只大鼠，一组先将烟花苷溶于1%的吐温80中，后用0.5%羧甲基纤维素钠进行稀释灌胃(50 mg kg-1)，给药后5、10、20、40、50、60、70、90、120、180、240、480、720、1440 min进行眼眶采血0.5 mL，置肝素抗凝离心管中，摇匀后离心，取上清液-20 ℃保存，采血过程中灌胃补充0.9%氯化钠溶液；另一组将烟花苷溶于1%的吐温80中，后用0.5%羧甲基纤维素钠进行稀释尾静脉注射(5 mg kg-1)，给药后5、10、15、20、25、30、45、60、90、120、180、240、300、360、720、1440 min进行眼眶采血0.5 mL，置肝素抗凝离心管中，摇匀后离心，取上清液-20 ℃保存，采血过程中灌胃补充0.9%氯化钠溶液。

2.5 血浆样品处理

吸取上清液200 μL，加入20 μL内标柚皮苷溶液(0.203 μg mL-1)，加500 μL甲醇，涡旋振荡1 min，12 000 r min-1离心10 min，取上清液，氮气吹干，150 μL甲醇复溶，过0.22 μm滤膜，进样。

2.6 专属性考察

取空白血浆、烟花苷对照品溶液、内标溶液以及大鼠给药后血浆样品适量，按2.5项方法处理后，在2.1项色谱条件测定，结果表明动物体内内源性物质不影响烟花苷的测定，见图2。

注：A.空白血浆；B.含对照品的空白血浆；C.灌胃给药后2 h血浆。图2 烟花苷及内标MRM离子色谱图

2.7 线性关系

取烟花苷储备液适量，用甲醇稀释成系列质量浓度的对照品溶液。取0.5、1、5、10、50、100、200、500、1000、2000、5000、8000 ng mL-1烟花苷溶液各200 μL，氮气吹干，加200 μL血浆涡旋2 min，按2.3项方法处理后，在2.1项色谱条件下进样测定相应峰面积。以样品血药浓度平方分之一(1/X2)为横坐标，样品峰面积与内标峰面积之比(Y)为纵坐标进行线性回归，得烟花苷回归方程Y=0.003X+0.02，(r>0.99)，烟花苷在0.5～8000 ng mL-1线性关系良好，按《中华人民共和国药典》相应方法求出最低检测限(LLOD)的S/N≥3，定量下限(LLOQ)的S/N≥10，并于一天内检测6次，3 d检测3批，计算所得RSD均小于15%，烟花苷的LLOD为0.5 ng mL-1，LLOQ为4 ng mL-1。

2.8 精密度与准确度

精密吸取烟花苷的对照品溶液，加入空白血浆制成质量浓度为1、50、500、5000 ng mL-1的烟花苷质控样品，按2.5项方法处理。不同质控样品各5份，连续5 d测定血浆日内、日间精密度，见表2。

表2 血浆中烟花苷的精密度与准确度(n=5)

2.9 基质效应与提取回收率

1)精密吸取烟花苷对照品溶液及内标溶液制成1、50、500、5000 ng mL-1的质控样品，按2.1条件下测定并记录烟花苷及内标的峰面积A、B，平行测定5次。2)分别取6只不同来源的大鼠空白血浆各200 μL，按照2.5方法处理，向获得的大鼠血浆样品中加入烟花苷和内标溶液，制备成浓度为 1、50、500、5000 ng mL-1的QC样品，取5 μL进行LC-MS/MS分析，获得色谱图峰面积分别为A1、B1。3)分别取1、50、500、5000 ng mL-1的QC样品各200 μL，氮气吹干，加含内标的大鼠空白血浆各200 μL，涡旋混匀按照2.5方法处理，获得色谱图峰面积分别为A2、B2。按照2015版《中华人民共和国药典》指导原则计算归一化后的基质效应和提取回收率。结果见表3。

表3 烟花苷的基质效应和提取回收率(n=6)

2.10 稳定性

精密吸取烟花苷的对照品溶液，加入空白血浆制成1、50、500、5000 ng mL-1的烟花苷质控样品，按2.5项方法处理，平行制样5份，分别置于20 ℃ 12 h，-80 ℃ 30 d，-20 ℃下反复冻融3次(每次间隔24 h)，4 ℃ 24 h，见表4。

表4 血浆中烟花苷在不同储存条件下的稳定性(n=5)

2.11 烟花苷的血浆药动学

烟花苷灌胃给药和尾静脉注射给药后，所得数据经DAS药代动力学软件处理，采用药代动力学程序进行非房室模型拟合。药代动力学参数结果见表5，血药浓度-时间曲线见图3，根据公式(1)，计算烟花苷的口服生物利用度为1.7%。

口服生物利用度F=[(AUC口服×静注的给药剂量)/(AUC静注×口服的给药剂量)]×100%

(1)

注：A.灌胃给药；B.静脉注射给药。图3 烟花苷在大鼠血浆中的血药浓度-时间曲线(n=6)

表5 烟花苷的药代动力学参数

注：—表示没有tmax值。

3 讨论

本研究建立了一种简便、灵敏的LC-MS/MS方法，用于研究烟花苷的药代动力学及生物利用度。结果表明，烟花苷的色谱总运行时间为12 min，LLOQ为0.5 ng mL-1，该方法快速、灵敏，可满足更广泛的检测要求。

血浆处理方法选择时，依照简单、方便的原则选择甲醇、10%的三氯乙酸、乙腈对血浆进行一步沉淀处理，10%的三氯乙酸处理所得色谱图中烟花苷回收率较低，故不选；乙腈处理所得色谱图中出现非检测成分的较大吸收峰，影响所选成分的检测，故不选；甲醇处理所得色谱图中烟花苷回收率良好，故选择甲醇对其进行沉淀蛋白。