皮肤中神经酰胺的研究及应用现状

王贺聪，何聪芬

（北京工商大学 理学院 北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）

神经酰胺（Ceramides, Cers）存在于所有的真核细胞中，对细胞分化、增殖、凋亡、衰老等生命活动具有重要调节作用。神经酰胺作为皮肤角质层细胞间脂质的主要成分，不仅在鞘磷脂途径中作为第二信使分子，还对表皮角质层形成过程发挥重要作用，具有维持皮肤屏障、保湿、抗衰老、美白和疾病治疗等作用。

图1 鞘脂类的结构式Fig.1 Structures of sphingolipids

1 神经酰胺概述

鞘脂类物质有3种，包括神经酰胺、鞘磷脂和鞘糖脂，结构式见图1。当R为氢时，该物质为神经酰胺；当R为磷酸胆碱或磷酸乙醇胺时，该物质为鞘磷脂（Sphingomyelin, SM）；当R为葡萄糖或半乳糖等糖类时，该物质为鞘糖脂（Glycosphingolipid, GL）。神经酰胺结构中有两条疏水链：一条长链氨基醇（long chain base, LCB），又称鞘氨醇，一条脂肪酸链（fatty acid, FA），LCB中的氨基和FA中的羧基通过酰胺键连接而成，LCB链长一般为C18[1]，表皮中组成神经酰胺的FA链长一般为C24～C36。人角质层中非酰基-神经酰胺的脂肪酸部分的链长主要为C24～C30，酰基-神经酰胺的链长为C30～C36，且含有奇数碳原子数脂肪酸的神经酰胺水平在角质层中较高（约占神经酰胺总量的30%）[2]。神经酰胺LCB碳链中的双键位置、羟基数目不同。FA的碳链长度不同，所以神经酰胺有不同种类，是结构相似的一类物质。

神经酰胺中的LCB分为神经鞘氨醇（Sphingosine,S）、二氢鞘氨醇（dihydrosphingosine, DS）、植物鞘氨醇（phytosphingosine, P）和6-OH鞘氨醇（6-hydroxy sphingosine, H），结构式见图2。FA分为非羟基脂肪酸（Nonhydroxyl fatty acid, N）、α-OH脂肪酸（α-hydroxyl fatty acid, A）和ω-OH脂肪酸（ω-hydroxyl fatty acid, EO），结构式见图3。根据LCB和FA的两两不同结合，可将皮肤角质层中神经酰胺分为12个亚类[3]，分别为NP（22.1%）、NH（14.5%）、AH（10.8%）、NDS（9.8%）、AS（9.6%）、AP（8.8%）、NS（7.4%）、EOS（6.5%）、EOH（4.3%）、ADS（1.6%）、EOP（1.1%）和EODs（0.4%），其中酰基神经酰胺（EOS、EOH、EOP、EODS）占角质层神经酰胺的12%[4]。若考虑到链长差异则神经酰胺目前发现有342种[5]，并且随着分析技术的提高，通过高分辨率质谱技术目前已检测出1 000多种神经酰胺[4]。

图2 4种长链氨基醇的结构式Fig.2 Structures of 4 kinds of LCB

图3 3种脂肪酸的结构式Fig.3 Structures of 3 kinds of fatty acids

2 体内神经酰胺的主要代谢途径

2.1 神经酰胺合成途径

神经酰胺是鞘磷脂代谢的中心环节，在体内内质网通过从头合成途径和鞘磷脂循环途径合成神经酰胺，在表皮层通过板层小体分泌至角质层构成细胞间脂质成分。

2.1.1 从头合成途径

细胞膜上丝氨酸与软脂酰辅酶A在丝氨酸棕榈酰转移酶的作用下形成3-羰基鞘氨醇，又在羰基还原酶的作用下形成二氢鞘氨醇，再经去饱和作用形成二氢神经酰胺，最终脱氢后形成神经酰胺。从头合成途径在细胞内质网进行，是体内基础水平神经酰胺的生成途径，所需时间较长，见图4。

图4 神经酰胺从头合成途径Fig.4 De novo synthesis pathway of ceramide

2.1.2 鞘磷脂循环途径

鞘磷脂合成酶是鞘磷脂从头合成途径的关键酶，以磷脂酰胆碱和神经酰胺为底物合成鞘磷脂和二脂酰甘油（diacylglycerol, DAG），鞘磷脂在鞘磷脂酶的作用下水解为神经酰胺，神经酰胺又可以被鞘磷脂重新利用，由此形成“鞘磷脂循环”，又称为补救合成途径。鞘磷脂循环发生在细胞膜，可在短时间内迅速生成神经酰胺，是一条快速产生神经酰胺的途径，见图5。

图5 鞘磷脂循环途径Fig.5 Cycle pathway of sphingomyelin

2.1.3 神经酰胺在表皮层的形成途径

人体皮肤中含有大量的神经酰胺，通过免疫组织化学反应发现基底细胞层和真皮层的神经酰胺主要分布于细胞核膜、线粒体内外膜、高尔基体、内质网和胞浆膜。在表皮上层，神经酰胺主要分布于板层小体、转运高尔基体、角化细胞的包膜和角质层细胞间隙[6]。

神经酰胺在表皮主要是通过板层小体释放入角质层细胞间，板层小体在角质形成细胞中，是一种双分子膜分泌细胞器，其中含有葡萄糖基神经酰胺、胆固醇和一些酶类物质，伴随角质形成细胞分化与细胞膜融合并胞吐形成神经酰胺、胆固醇和游离脂肪酸等脂质，对细胞间脂质的分泌有重要作用[7]，具体途径见图6。

图6 表皮板层小体脂质的合成和分泌过程[7]Fig.6 Synthesis and secretion of lamellar body in epidermis[7]

在细胞间质，葡萄糖基神经酰胺和鞘磷脂分别在板层小体被β-葡糖脑苷脂酶和酸性鞘磷脂酶转变为神经酰胺[8-10]。

2.2 神经酰胺合成相关酶

2.2.1 鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synathase, SMS）

SMS是鞘磷脂合成的一种关键酶。大多数哺乳动物细胞含有存在于高尔基体内的SMS1和主要在细胞膜上的SMS2两种亚型[11]。SMS1和SMS2可将磷脂酰胆碱的磷酸胆碱基团转移到神经酰胺生成鞘磷脂和二脂酰甘油，反应的方向性主要决定于膜上神经酰胺和二脂酰甘油以及磷酸胆碱受体的相对浓度[12]。

神经酰胺在内质网产生后，被运送到高尔基体，大部分神经酰胺被位于高尔基体的SMS1转化为鞘磷脂[13]。神经酰胺的分解产物二脂酰甘油或蛋白激酶C活化剂佛波酯能抑制神经酰胺介导的细胞调亡。

2.2.2 神经酰胺合成酶

哺乳动物有6种神经酰胺合成酶，每种酶对不同链长的酰基辅酶表现出特有的底物特异性[14]。除CER3合成酶和CER4合成酶存在于表皮及皮脂腺外，其他4种酶均在小肠及肝肾中。其中CER3合成酶主要存在于表皮层，底物酰基辅酶A大于等于十八碳，主要参与皮肤屏障的形成和精子的发生[15，16]。已有研究[17]表明CER3合成酶的缺乏会导致皮肤屏障缺陷引起鱼鳞病，皮肤呈干燥、增厚和鳞片状，还会导致新生儿致死性鱼鳞病。CER4合成酶存在于表皮及皮脂腺中，通常以C18、C22辅酶A为底物[18]。CER4合成酶基因敲除小鼠会出现毛囊阻塞导致毛发减少，并伴随C18和C20神经酰胺水平下降[19]。

2.3 神经酰胺分解相关酶

2.3.1 鞘磷脂酶

鞘磷脂酶是鞘脂类代谢中研究较为广泛的酶，其作用是水解鞘磷脂的磷酸二酯键，生成神经酰胺和磷脂酰胆碱，是神经酰胺合成过程的关键酶。

中性鞘磷脂酶家族有3个成员分布于哺乳动物体内：主要定位于核基质、内质网等细胞器的中性鞘磷脂酶-1；广泛存在于细胞质膜的胞浆面，与阿尔茨海默病的发展、骨骼生长有关中性鞘磷脂酶-2[20]；主要分布于心肌、条纹肌细胞内质网和高尔基复合体中的中性鞘磷脂酶-3[21]。酸性神经鞘磷脂酶作为神经鞘磷脂酶最重要的一个亚型，占神经鞘磷脂酶总活性的90%，在辐射诱导细胞凋亡、调节肿瘤细胞生长等方面均可发挥重要作用。酸性神经鞘磷脂酶在一定的外源刺激下能快速活化并释放到细胞表面，水解细胞膜上的鞘磷脂，导致神经酰胺水平迅速上升，激活鞘磷脂循环途径。以上两种神经鞘磷脂酶均是通过水解神经鞘磷脂，调控胞内第二信使神经酰胺水平，参与细胞的应激、生长、分化和凋亡过程的调控。

2.3.2 神经酰胺酶

神经酰胺酶是清除神经酰胺的关键酶，神经酰胺可被神经酰胺酶分解成LCB，LCB又可在鞘氨醇激酶的作用下生成1-磷酸鞘氨醇，将细胞凋亡信号转化为细胞增殖信号。迄今为止，已鉴定出5种由5种不同基因编码的人神经酰胺酶：酸性神经酰胺酶（AC）、中性神经酰胺酶（NC）、碱性神经酰胺酶1 （Acer 1）、碱性神经酰胺酶2 （Acer 2）和碱性神经酰胺酶3 （Acer 3）。其中AC定位于溶酶体，具有调节细胞活力的作用；NC定位于质膜，主要表达于小肠和结肠，可参与消化过程，与结肠癌的发生有关[22]；Acer分布于细胞内质网及高尔基体，3种类型Acer的活性均可被钙离子增强，被锌离子和神经鞘氨醇抑制[23]。表皮角质形成细胞中Acer 1的高表达可使鞘氨醇和1-磷酸鞘氨醇水平上升，长链神经酰胺水平下降，促进Ca2+诱导的表皮角质形成细胞的生长抑制和分化作用[24]。Acer 2可促进细胞LCB和1-磷酸鞘氨醇的产生，但Acer 2过表达导致的LCB过量生成和积累使得细胞高尔基体破裂而诱发细胞生长抑制[25]。Acer 3参与运动协调相关的浦肯野细胞变性，还可通过调控神经鞘脂代谢影响与衰老有关的神经退行性疾病，如小脑的共济失调等[26]。

3 神经酰胺的制备、分离及检测方法

3.1 神经酰胺的制备方法

获取神经酰胺的方式主要有3种：天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。

天然提取的神经酰胺来源于动物和植物。动物中来源于有致病风险的动物脑部，所以不可应用于化妆品中[27]。而植物中魔芋提取的神经酰胺含量为其他植物的十几倍[28]。但植物提取方法受植物生长周期和季节的限制，产量较低。

化学合成的主要是拟神经酰胺，其结构与神经酰胺相似，功能相似，可应用于化妆品中，目前已有多种拟神经酰胺成功合成，爱茉莉太平洋公司目前已生产出一种新型拟神经酰胺，提高了其溶解度和稳定性，其技术路线是将三羟甲基氨基甲烷溶于二甲基甲醛（DMF），再溶于三乙胺（Et3N），30 min后加入棕榈酰氯经过一系列反应再引入脂肪酸，反应式见图7[29]。

图7 新型拟神经酰胺合成途径Fig.7 Synthesis pathway of a new pseudo ceramide

微生物发酵法是近年来的常用制备神经酰胺的方法，即应用雪氏毕赤酵母（Pichiaciferrii）或酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在一定环境下发酵得到四乙酰植物鞘氨醇（TAPS）[30，31]，其结构式见下，再对其去乙酰化得到植物鞘氨醇，加入脂肪酸合成神经酰胺等物质[32]。生物发酵法外界干扰因素较少，可大量生产且降低神经酰胺的价格，更利于其在产品中的广泛应用。

3.2 神经酰胺的分离方法

目前神经酰胺的分离方法主要包括薄层色谱法、高效液相色谱法和气相色谱法。

角质层神经酰胺的分离方法主要是薄层色谱法和高效液相色谱法。薄层色谱法是较为传统的分离方法，通过流动相将样品在固定相上分离出来，含量较低的样品用此方法有一定的限制。高效液相色谱法是以液体为流动相，利用高压输液原理将其泵入装有固定相的色谱柱中，在柱内实现各成分的分离，再通过检测系统进行化合物检测。正相色谱是常用的神经酰胺的分离方法，但有研究[33]表明反向色谱更有利于同类但碳链长度不同的神经酰胺的分离。

3.3 神经酰胺的检测方法

神经酰胺较常用的检测方法主要有蒸发光散射法、荧光标记荧光检测法和质谱法。

蒸发光散射法是通过将流动相完全挥发，测定留下来的样品颗粒的光散射。该方法无流动相干扰，所以结果基线平稳，常与高效液相色谱联用检测神经酰胺的含量。该方法已经成功应用于魔芋中神经酰胺的检测，所得结果重现性良好[34]。荧光标记荧光检测法是通过一定的衍生化方法使样品对荧光敏感，从而实现对神经酰胺的间接荧光检测，常用的荧光试剂包括邻苯二甲醛和丹磺酰氯等。使用荧光分析神经酰胺类物质发展较快，解决了蒸发光散射法检测系统灵敏度低的问题[35]。质谱法是通过电场和磁场将样品按质荷比进行分析，灵敏度较高，是目前发展较快且较常使用的分析方法，可对皮肤、头发等部位的微量神经酰胺进行检测[36]。

4 神经酰胺的研究及应用现状

4.1 在医药中的研究及应用现状

在所有的神经酰胺中，短链神经酰胺（C2、C4、C6和C8）细胞渗透性高，无论是单独还是与传统的抗癌药物联用，都具有很好的抗肿瘤活性[37]。化疗药物vorinostat和sorafenib通过从头合成途径和酸性鞘磷脂酶水解途径提高细胞内神经酰胺含量，激活内质网应激并诱导肿瘤细胞凋亡[38]。

神经酰胺在心血管疾病中有重要作用，当心肌缺血时神经酰胺含量升高，促进心肌细胞凋亡，防止加重心脏负担，当心脏再灌注出现时，神经酰胺含量下降，凋亡现象逆转，心功能改善。低浓度的神经酰胺处理缺血再灌注的小鼠模型可使梗死面积减小，保护心脏[39]。

神经酰胺在皮肤病的治疗中也有重要作用，特应性皮炎[40]、湿疹[41]和银屑病[42]等疾病都是由于皮肤屏障功能受损所致，均表现为神经酰胺含量下降，碳链长度变短等。应用加入神经酰胺的药物治疗可显著增加皮肤含水量，增强皮肤屏障功能。

4.2 在化妆品中的研究及应用现状

4.2.1 维持和增强皮肤屏障作用机理及其在抗敏化妆品中的应用

神经酰胺在表皮层是通过板层小体将葡萄糖基神经酰胺分解再将其从颗粒层转运至角质层，在此过程中ATP结合盒转运子超家族A12（ABCA12）可促进葡萄糖基神经酰胺在板层小体的聚集[43]。并且有研究[44]表明ABCA12缺失会导致丑角样鱼鳞病的发生。含有ω-OH的神经酰胺能共价结合于角化细胞的角化包膜的内披蛋白上，由此将脂质基质和角化细胞连接起来，增强皮肤的屏障功能，减少有害物质通过毛孔、汗腺进入皮肤，从而具有抗敏功效。花王公司利用其开发的神经酰胺类似物作用于乳酸刺激敏感的患者，4周后患者皮肤状况均改善，敏感性下降[45]，说明神经酰胺有较强的抗敏功效。

4.2.2 保湿作用机理及其应用

神经酰胺有两条长链烃基（一条是LCB中的碳链，一条是FA中的碳链），具有疏水性。LCB中的2～3个羟基基团与FA和LCB结合部位的酰胺键具有亲水性，这两种性质对其在角质层的保水作用具有重要意义。此外，神经酰胺可明显促进丝聚合蛋白mRNA和蛋白的表达水平[46]。其中，丝聚合蛋白原从颗粒层进入角质层时，经过一系列酶水解转化为多羧酸类物质，具有保湿功效。丝聚合蛋白不仅是重要的结构蛋白，而且是保湿因子的主要来源。有研究[47]表明神经酰胺的保湿功效是透明质酸的16倍，为高效保湿剂，易被皮肤吸收，同时能促进其他营养物质渗透，对老年干性皮肤保湿效果高达80%。

4.2.3 抗衰老作用机理及其应用

神经酰胺中的鞘氨醇碳链具有双键，且有端位羟基，说明其易氧化使双键断裂，因此具有抗氧化的作用。有研究[48]表明低浓度的神经酰胺可刺激成纤维细胞增殖，并抑制基质金属蛋白酶的表达，因此神经酰胺有一定的抗衰老功效。

研究[49]表明水溶性神经酰胺（小麦神经酰胺+双半乳糖基二酰甘油酯（DGDG））有三重抗衰老功效：一是通过降低水分流失保持表皮的水分；二是激活成纤维细胞的活性，产生胶原蛋白等物质；三是激活基质金属蛋白酶系列酶抑制剂（TIMP-1）的活性；来源于植物的水溶性神经酰胺对于抑制人体白细胞弹性蛋白酶和胶原蛋白酶也有显著作用，对抗衰老化妆品的研发有一定的指导意义。

4.2.4 抑制黑色素合成机理及其应用

神经酰胺抑制黑色素合成的机制尚不清楚，但已有关于神经酰胺抑制黑色素合成的研究，并推测其可能是通过抑制细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）和Akt/蛋白激酶B（PKB），使黑素细胞中ERK延迟激活大于1 h，PKB延迟激活大于3 h，从而抑制黑色素的合成[50]。目前尚未出现神经酰胺作为美白原料的化妆品，但已有关于其在黑色素瘤方面的研究，它可抑制黑色素瘤细胞，但对正常黑素细胞无损害作用[51]，由此推测神经酰胺应用于伤口或炎症导致的色素沉着方面可能会有良好的改善作用。

5 结束语

神经酰胺在体内可作为一种结构成分，在角质细胞间起到保湿、抗衰老、抗敏、美白的作用；也可作为信号分子，对细胞的增殖、分化、凋亡起调节作用。外源性神经酰胺应用于化妆品中可增强皮肤屏障作用，用于药物可与抗癌药物协同治疗癌症。神经酰胺在化妆品和药物中的应用具有广阔的发展前景。

目前神经酰胺主要应用于特应性皮炎、湿疹等皮肤屏障功能障碍性疾病，对于其促进凋亡和抗衰老、美白功效应用较少。我们应进一步探讨神经酰胺在化妆品中的应用，通过利用其促进凋亡的作用可以对神经酰胺的浓度、种类进行筛选，从而开发促进增生性痘印消退的产品。另外，神经酰胺种类较多，不同神经酰胺在不同肤质人群中的作用仍有待研究，随着脂质组学和大数据的发展，将这两项技术应用于神经酰胺在不同肤质人群的研究，通过数学建模的思想进行不同神经酰胺在不同肤质人群中的预测，可为其在医药和化妆品科学领域的应用提供新的方向。