磷酸鞘氨醇对胰腺癌PANC1细胞迁移、侵袭能力的影响

田波　隋淑静　孟茜茜　刘培培　林寒　辛磊　李兆申　王洛伟

200433　上海，第二军医大学长海医院消化内科(田波、孟茜茜、刘培培、林寒、辛磊、李兆申、王洛伟)；泰安市中心医院消化内一科(隋淑静)



·论著·

磷酸鞘氨醇对胰腺癌PANC1细胞迁移、侵袭能力的影响

田波隋淑静孟茜茜刘培培林寒辛磊李兆申王洛伟

200433上海，第二军医大学长海医院消化内科(田波、孟茜茜、刘培培、林寒、辛磊、李兆申、王洛伟)；泰安市中心医院消化内一科(隋淑静)

【摘要】目的观察磷酸鞘氨醇(S1P)干预对胰腺癌PANC1细胞侵袭、转移能力的影响。方法采用20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干预PANC1细胞24 h，以未干预细胞作为对照组。另采用S1P特异性受体拮抗剂VPC23019 10 μmol/L 预处理1 h后再应用100 nmol/L S1P干预PANC1细胞24 h(VPC+S1P组)，同时设单用S1P干预(S1P组)、单用VPC23019处理(VPC组)及未处理的对照组。采用荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测各组细胞N-Cadherin mRNA和蛋白表达，采用划痕实验和Transwell小室检测细胞的迁移、侵袭能力。结果对照组及20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干预组细胞N-Cadherin mRNA表达量分别为1.000±0.061、1.240±0.106、1.547±0.085、1.827±0.114、2.160±0.164、1.767±0.146、1.493±0.163，以100 nmol/L S1P干预组的表达量最高，各干预组均显著高于对照组，差异有统计学意义(P值均<0.05)。对照组、S1P组、VPC组、VPC+S1P组细胞N-Cadherin mRNA表达量分别为1.000±0.114、2.273±0.341、0.920±0.096、0.340±0.110；对照组、S1P组、VPC+S1P组N-Cadherin蛋白表达量分别为1.000±0.176、2.167±0.242、0.510±0.151，细胞迁移率分别为(32.5±2.6)%、(57.5±3.3)%、(11.2±3.5)%，穿膜细胞数分别为(79±4.3)、(168±5.7)、(55±3.7)个/200倍视野。S1P组较对照组显著增加，VPC+S1P组较S1P组及对照组显著减少，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。结论S1P干预可增强胰腺癌PANC1细胞的迁移、侵袭能力，应用S1P特异性受体拮抗剂VPC23019预处理可完全阻断S1P的作用，其机制可能与下调N-Cadherin基因表达有关。

【关键词】胰腺肿瘤；鞘氨醇；VPC23019；N-Cadherin；细胞系，肿瘤

Fund program：Natural Science Foundation of China(30700360)

磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是细胞膜鞘磷脂的代谢产物，通过与S1P异三聚体G蛋白耦联受体(S1PR)结合介导机体炎症反应、细胞增殖迁移、血管生成等多种生理活动，同时在多种恶性肿瘤发生和发展过程中具有重要作用。研究表明，当S1P与S1PR1/S1PR3结合时，肿瘤的侵袭转移能力提高，而沉默受体表达或拮抗受体的方法可以有效降低S1P诱导的肿瘤侵袭转移。N-Cadherin是连接细胞骨架、增强细胞运动性的钙黏蛋白，与肿瘤细胞间黏附蛋白的表达、微血管生成密切相关[1]。正常细胞从紧密连接的极性上皮细胞转化为非极性的、能自由侵袭的细胞时N-Cadherin表达相应增加，抑制N-Cadherin的表达可以降低肿瘤发生转移的能力[2-3]。因此，本研究应用S1P特异性受体拮抗剂VPC23019处理S1P刺激后的胰腺癌PANC1细胞，观察其对癌细胞侵袭转移能力的影响，探讨其可能机制。

材料和方法

一、荧光定量PCR法检测细胞N-Cadherin mRNA表达

人胰腺癌细胞株PANC1为长海医院保存，常规培养、传代。取对数生长期细胞，待培养至70%融合状态时用无血清DMEM培养过夜。加入终浓度为20、40、80、100、150、200 nmol/L的S1P(Sigma公司)干预24 h，以未处理细胞作为对照组，每组设3个复孔。另取对数生长期细胞，分为对照组、S1P组、VPC组、VPC+S1P1组、VPC+S1P2组。S1P组应用100 nmol/L S1P干预24 h，VPC组应用10 μmol/L VPC23019处理24 h，VPC+S1P1组、VPC+S1P2组分别用1、10 μmol/L VPC23019预处理1 h后再应用100 nmol/L S1P干预24 h，以未处理细胞作为对照组，每组设3个复孔。

收集上述各组细胞，采用Trizol试剂提取细胞总RNA,先逆转成cDNA，再行荧光定量PCR检测N-Cadherin mRNA表达量。N-Cadherin引物序列为5′-AGCCAACCTTAACTGAGGAGT-3′和5′-GGCAAG-TTGATTGGAGGGATG-3′，扩增产物136 bp；内参GAPDH引物序列为5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′和5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG-3′，扩增产物197 bp。引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。PCR反应参数：95℃ 20 s，95℃ 10 s、60℃ 20 s、72℃ 10 s，40次循环。实验重复3次，取均值。由仪器自带软件获取Ct值，以对照组细胞N-Cadherin mRNA表达量为1，计算处理组细胞N-Cadherin mRNA相对表达量。

二、划痕实验检测细胞迁移能力

取对数生长期细胞，以5×105/孔接种于6孔板，分为对照组、S1P组、VPC+ S1P组(VPC预处理浓度为10 μmol/L)，每组设3个复孔。培养至约90%融合时弃去培养液，用10 μl的移液枪头在平板中间划一条横线，PBS冲洗3次，按上述分组配制无血清DMEM培养液培养24 h。在处理当时(0 h)及培养24 h时测量划痕的距离。

细胞迁移率=[(0 h划痕距离-24 h划痕距离)/0 h划痕距离]×100%

三、Transwell小室检测细胞侵袭能力

Transwell小室购自Costar公司。每个小室的聚碳酸酯膜上加50 μl用无血清DMEM培养液稀释的Matrigel，待其充分聚合，Transwell下室加入600 μl含10% FBS的DMEM培养液，Transwell上室加100 μl用无血清DMEM培养液稀释的5×105/ml的细胞悬液。实验分为对照组、S1P组、VPC+S1P组(VPC预处理浓度为10 μmol/L)，每组3个小室。培养48 h后取出Transwell小室隔膜，用棉签拭去膜表面的Matrigel，无水乙醇固定细胞，PBS冲洗晾干，然后用0.1%结晶紫染色10 min，去除多余结晶紫染液，光镜下随机选取5个200倍视野，计数穿膜细胞数，取均值。

四、蛋白质印迹法检测N-Cadherin蛋白表达

取上述各组培养48 h的PANC1细胞，用RIPA裂解液制备细胞总蛋白，测定蛋白浓度，常规行蛋白质印迹法检测N-Cadherin蛋白表达，以β-actin为内参。兔抗人N-Cadherin、β-actin抗体均购自Abcam公司，工作浓度分别为1∶5 000,1∶3 000。最后ECL显影，胶片曝光、显影、定影。用凝胶图像软件分析系统扫描胶片，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白的相对表达量。

五、统计学处理

结果

一、各组PANC1细胞N-Cadherin mRNA表达量的变化

对照组细胞N-Cadherin mRNA表达量为1.000±0.061；20、40、80、100、150、200 nmol/L S1P干预组细胞N-Cadherin mRNA表达量分别为1.240±0.106、1.547±0.085、1.827±0.114、2.160±0.164、1.767±0.146、1.493±0.163，其中100 nmol/L S1P干预组的表达量最高。各干预组均显著高于对照组，差异有统计学意义(P值分别0.027、0.001、0.000、0.000、0.001、0.008)。

VPC23019预处理实验中，对照组、S1P组、VPC组、VPC+S1P1组、VPC+S1P2组细胞N-Cadherin mRNA表达量分别为1.000±0.114、2.273±0.341、0.920±0.096、0.617±0.057、0.340±0.110。VPC组与对照组的差异无统计学意义(P=0.405)。S1P组较对照组显著增加，VPC+S1P1组、VPC+S1P2组较S1P组显著下降，差异均有统计学意义 (P值分别为0.004、0.006、0.002)。

二、各组PANC1细胞N-Cadherin蛋白表达量的变化

对照组、S1P组、VPC+S1P组N-Cadherin蛋白相对表达量分别为1.000±0.176、2.167±0.242、0.510±0.151。S1P组较对照组显著增加，VPC+S1P组较S1P组及对照组均显著减少，差异均有统计学意义(P值分别为0.003、0.001、0.022)。

三、各组PANC1细胞迁移能力的变化

对照组、S1P组、VPC+S1P组细胞迁移率分别为(32.5±2.6)%、(57.5±3.3)%、(11.2±3.5)%，S1P组较对照组显著增加，VPC+S1P组较S1P组及对照组均显著下降，差异均有统计学意义(P值分别为0.001、0.000、0.001)，见图1。

图1　对照组(上)、S1P组(中)、VPC+S1P组(下)细胞迁移情况(×40)

四、各组PANC1细胞侵袭能力的变化

对照组、S1P组、VPC+S1P组穿膜细胞数分别为(79±4.3)、(168±5.7)、(55±3.7)个/200倍视野。S1P组穿膜细胞数较对照组显著增加，VPC+S1P组较S1P组及对照组均显著减少，差异均有统计学意义(P值分别为0.000、0.006、0.000)，见图2。

讨论

脂类代谢的异常与胰腺癌的发生和发展关系密切，许多脂类及脂代谢关键酶的血浆浓度和胰腺癌患者的病理分期、对放化疗的敏感性及预后密切相关[4-5]。S1P是一种由细胞膜鞘磷脂受鞘氨醇激酶催化生成的代谢产物，通过与细胞膜表面S1P受体(S1PR)结合，发挥生物学作用。S1PR为G蛋白耦联受体家族成员，迄今共发现5型,其中S1PR1～3广泛分布于人体各种组织中，对血管生成、免疫调节等机体生理活动起着重要作用[4-5]。血浆中S1P大部分以与脂蛋白结合的形式存在，极少部分为游离状态。以往多项研究[6-8]证明，S1P通过与乳腺癌、前列腺癌等恶性肿瘤细胞表面受体结合影响肿瘤细胞增殖和侵袭、转移能力，其生物学活性受结合受体类型、S1P浓度等因素影响。当S1P与S1PR1、3两个受体相结合时会增加肿瘤的恶性程度，而与S1PR2结合则可拮抗该作用。Sutphen等[9]报道，卵巢癌患者血浆S1P浓度与肿瘤恶性进程密切相关，肿瘤切除后血浆S1P浓度明显下降。

图2对照组(2A)、S1P组(2B)、VPC+S1P组(2C)穿膜细胞(×40)

N-Cadherin是一种在细胞膜之间接触层面高表达，并且可以内在连接细胞骨架，增强细胞运动性的钙黏蛋白，其高表达可以导致胰腺癌转移侵袭能力增强、肿瘤的分化程度降低等，是胰腺癌上皮间质转化的重要作用分子[2]。VPC23019为一种人工合成的S1PR1、3受体拮抗剂，其化学结构与S1P有一定的相似，可以特异性抑制S1P与S1PR1、3的结合，阻滞部分S1P下游通路的激活[10]。

本研究结果显示，S1P干预PANC1细胞后，N-Cadherin蛋白表达量增加，以100 nmol/L S1P干预时的表达量增加最明显，同时PANC1细胞的侵袭、转移能力增强。单用VPC处理PANC1细胞，N-Cadherin mRNA表达不受影响，但用VPC预处理后再用S1P干预细胞时N-Cadherin mRNA及蛋白表达量较单用S1P干预组显著下降，细胞的侵袭转移能力显著被抑制，而且也较对照组细胞下降，提示S1P干预PANC1细胞后通过增加N-Cadherin基因表达而抑制癌细胞的侵袭、转移能力，用S1PR1、3受体拮抗剂预处理则可完全阻断S1P的作用。因此，采用特异性阻滞S1P通路抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力可能成为治疗胰腺癌的新靶点。

参考文献

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(本文编辑：吕芳萍)

The influence of sphingosine 1-phosphate on migration and invasion of pancreatic cancer PANC1 cells

TiaoBo,SuiShujing,MengQianqian,LiuPeipei,LinHan,XinLei,LiZhaoshen,WangLuowei.DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai, 200433China

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of sphingosine 1-phosphate (S1P) on cell migration and invasion in pancreatic cancer PANC1 cells. MethodsDifferent concentrations (20, 40, 80, 100, 150, 200 nmol/L) of S1P was used to treat PANC1 cells for 24 h and untreated cells were used as control. Cells were pretreated by 10 μmol/L VPC23019 for 1 h and then treated by 100 nmol/L S1P in VPC+S1P group, only treated by S1P in S1P group, and only treated by VPC23019 in VPC group, and untreated in control group. Fluorescent quantitative PCR and Western blot were used to detect N-Cadherin mRNA and protein expression, and wound healing test and transwell chambers were used to detect cell migration and invasion.

ResultsN-Cadherin mRNA expression in control, 20, 40, 80, 100, 150, 200 nmol/L S1P group was 1.000±0.061,1.240±0.106,1.547±0.085,1.827±0.114,2.160±0.164,1.767±0.146,1.493±0.163, and 100 nmol/L S1P stimulated the highest N-Cadherin expression. N-Cadherin mRNA expression in control, S1P, VPC and VPC+S1P group was 1.000±0.114,2.273±0.341, 0.920±0.096, 0.340±0.110, respectively. N-Cadherin protein expression in control, S1P, VPC+S1P group was 1.000±0.176, 2.167±0.242, 0.510±0.151; cell migration rate was (32.5±2.6)%, (57.5±3.3)%,(11.2±3.5)%; and the transmembrane cell numbers were 79±4.3,168±5.7, 55±3.7 cell2 in each view a maginification of 200 times. Cell migration and invasion in S1P group were significantly increased, and those in VPC+S1P group were dicreased when compared with S1P and control group (allP<0.05). ConclusionsS1P can increase the migration and invasion ability of PANC1 cells, and pretreatment of S1P specific inhibitor VPC23019 could completely abolish the function of S1P.The molecular mechanism may be associated with reducing the expression of N-Cadherin.

【Key words】Pancreatic neoplasms；Sphingosine；VPC23019；N-Cadherin；Cell line, tumor

(收稿日期：2015-12-29)

Corresponding author:Wang Luowei, Email: phdwang@hotmail.com

基金项目：国家自然科学基金(30700360)

通信作者：王洛伟，Email:phdwang@hotmail.com

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.02.001

共同第一作者：隋淑静