LC-MS/MS法测定蜂胶类牙膏中白杨黄素的含量

韩雅楠，苏慧锋

（乌海职业技术学院 化工系，内蒙古 乌海 016000）

蜂胶是工蜂从植物体上采集的树脂和与其上颚腺、蜡腺的分泌物混合而形成的具有粘性、芳香气味的固体胶状物质[1，2]，其主要化学成分为黄酮类化合物，其中白杨黄素（chrysin，ChR）在蜂胶中含量较高[3，4]。ChR又称白杨素、5，7-二羟黄酮，可从多种植物（木蝴蝶、山柏松、芒松）、蜂蜜和蜂胶中提取的一种天然黄酮类化合物，具有抗菌、消炎、降血脂、抗糖尿病、抗氧化和防心脑血管疾病等[5-8]，对肿瘤细胞具有抑制增殖和诱导凋亡等抗肿瘤活性，常以蜂胶提取物形式被添加到食品、药品和化妆品中，尤其是各种功效型牙膏，用以预防或减轻牙菌斑、牙龈肿痛、口腔溃疡和口臭等口腔问题。QB/T 2966-2014《功效型牙膏》和国家食品药品监督管理总局公告《化妆品功效宣称评价指导原则》（征求意见稿）中关于功效评价及安全性要求，功效成分应进行定性或定量检测。

目前关于ChR的检测方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[9-14]，该法具有简便易用、效率高，但易受杂质干扰、灵敏度不高，且检测的ChR对象主要为蜂胶，而关于蜂胶类牙膏等复杂基质中ChR的检测报道较少。液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）是将液相色谱仪的高效分离能力与质谱仪的强组分鉴定能力结合，是有效分离分析复杂混合物的可靠方法，关于LC-MS/MS法测定ChR的报道较少[15，16]。本文采用甲醇提取蜂胶类牙膏中ChR，冷冻离心净化，经Diamonsil C18色谱柱分离，质谱检测器检测，建立LC-MS/MS法测定蜂胶类牙膏中ChR的含量，以期为蜂胶类牙膏中功效成分ChR的定性或定量提供检测方法。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

ChR （CAS 480-40-0，分子式C15H10O4，分子量254.24，纯度99.9%，20 mg），色谱纯，成都普瑞法科技开发有限公司；甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷、乙酸铵，色谱纯，美国TEDIA公司；其余所用试剂均为分析纯，上海化学试剂厂；8种不同品牌的功效型牙膏，购自苏宁易购网上商城。

Waters ACQUITY UPLC/ Xevo TQ MS型超高效液相色谱-串联质谱仪，美国Waters公司；CPA324S型电子天平，德国Sartorius公司；SK8300BT型超声清洗器，上海汉克科学仪器有限公司；Milli-Q型超纯水器，美国Millipore公司；vortex-genie2型涡旋混合器，美国Scientific Industries公司；5427R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；Syncore Polyvap多样品平行蒸发仪，瑞士BUCHI公司。

1.2 标准溶液的配制

准确称取ChR标准物质10 mg（精确到0.1 mg），置于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容配制成质量浓度为1 g/L的标准储备液。取ChR标准储备液适量，用乙腈逐级稀释得到质量浓度依次为5.0，10.0，25.0，50.0和100.0 μg/L的标准工作溶液。

1.3 LC-MS/MS条件

液相色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）；柱温为30 ℃；进样量为10 μL；流速为0.3 mL/min；流动相A为0.2 mmol/L 乙酸铵溶液；流动相B为乙腈。梯度洗脱程序：0～5.0 min，20%～80%B；5.0～7.0 min，80%～100% B；7.0～7.1 min，80% B；7.1～10.0 min，80%～20% B。

质谱条件：采用电喷雾离子化负离子采集模式（ESI-）；离子源温度120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；毛细管电压3.5 kV；脱溶剂气为N2，600 L/h；锥孔气N2，50 L/h；碰撞气Ar，0.06 mL/min；检测方式为多反应监测（MRM）；定性离子对（m/z）为253.2/172.1；定量离子对（m/z）为253.2/120.2；锥孔电压20 V；碰撞能量25 V。

1.4 样品前处理

准确称取蜂胶类牙膏2.0 g（精度0.1 mg），置于50 mL离心管中，加入2 mL饱和氯化钠溶液，涡旋30 s分散均匀，加入20 mL 甲醇，涡旋30 s分散均匀后超声提取30 min，10 000 r/min冷冻离心10 min，收集上清液；残渣用20 mL甲醇再涡旋混匀超声提取30 min，10 000 r/min离心10 min，合并上清液，45 ℃旋转蒸发至干，用1 mL乙腈涡旋溶解后，经0.22 μm有机滤膜过滤，供LC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

采用蠕动泵以1.0 μL/min的流速将1.0 mg/L ChR标准工作溶液连续注入ESI离子源中，分别进行正负离子检测方式对ChR进行一级质谱分析（母离子扫描）；对准分子离子峰进行二级质谱分析（子离子扫描）。结果表明：在负离子检测方式下，获得准分子离子[M-H]-信号较强（m/z 253.2），且干扰较小，这可能与ChR分子结构中羟基易失去H有关；对准分子离子[M-H]-进行子离子扫描，以得到的丰度较大的两个碎片离子m/z 172.1和m/z 120.2作为定性离子，以其中丰度较大的碎片离子m/z 120.2作为定量离子（见图1）。

图1 ChR的二级质谱图Fig.1 Secondary mass spectrum of chrysin

2.2 色谱柱的选择

考察了Waters BEH C18、X Bridge C18、Diamonsil C18、Zorbox SB C18、Shim-pack VP-ODS C18等不同液相色谱柱对蜂胶类牙膏中ChR的分离效果。结果表明：在相同流动相的前提下，采用Diamonsil C18色谱柱能够提供较好的分离效果，ChR色谱峰峰形对称，保留时间5.32 min适中，质谱响应值较高（见图2），故选择Diamonsil C18作为色谱分析柱。

图2 ChR标准工作溶液总离子流图Fig.2 Total ion chromatogram of chrysin standard solution

2.3 流动相的选择

考察了不同流动相体系（甲醇/乙腈-水、甲醇/乙腈-醋酸水溶液、甲醇/乙腈-磷酸缓冲液、甲醇/乙腈-乙酸铵溶液）对目标物ChR的分离效果和离子化效率的影响。结果显示：乙腈作为有机相对ChR的分离效果优于甲醇；流动相体系中酸度越强，采用正离子模式检测的化合物相应越高，采用负离子模式检测的化合物相应受到抑制。在负离子检测方式下，选择以乙腈-水为流动相时，ChR出现峰展宽及拖尾现象，这可能是由于ChR结构中2个羟基与C18色谱柱中的硅羟基发生弱离子交换作用，从而导致峰展宽及拖尾现象；选择以乙腈-乙酸铵溶液为流动相时，ChR的分离效果明显改善，尤其是以乙腈-0.2 mmol/L 乙酸铵为流动相对ChR进行洗脱，ChR的分离效果良好，色谱峰峰形对称，且响应值较高。故选择乙腈-0.2 mmol/L 乙酸铵溶液作为流动相。

2.4 提取和净化方式的选择

考察了甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和正己烷等不同提取溶剂对蜂胶类牙膏中ChR的提取效果及净化方式的选择。结果显示：ChR可溶于甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇和乙酸乙酯中，微溶于二氯甲烷和正己烷；依据不同提取溶剂对ChR提取回收率高低排序为：丙酮（97.8%）＞甲醇（97.2%）＞乙腈（92.1%）＞异丙醇（86.4%）＞乙酸乙酯（81.3%）＞二氯甲烷（62.8%）＞正己烷（51.3%），其中丙酮对ChR的提取回收率最高，但丙酮萃取液存在部分杂质峰或干扰峰；而甲醇对ChR的提取回收率为97.2%，杂质峰或干扰峰较少，但提取后存在提取液起泡现象；采用添加饱和氯化钠溶液可消除提取液起泡现象，且经冷冻离心可将提取溶液与蜂胶类牙膏基质中碳酸钙、磷酸氢钙、二氧化硅等成分有效分离，减少对ChR的干扰。故选择甲醇作为提取溶剂及冷冻离心净化方式。

2.5 基质效应的考察

为避免蜂胶类牙膏基质对LC-MS/MS法测定ChR过程中的影响或干扰，采用标准加入法计算基质效应（matrix effect，ME），ME=（B/A-1）×100%，式中，A为纯乙腈基质中ChR的响应值，B为空白蜂胶类牙膏基质中ChR的响应值。当ME＞10%，说明存在基质增强效应；当-10%＜ME＜10%，说明不存在基质效应；当ME＜-10%时，说明存在基质减弱效应。结果显示：在纯乙腈和空白蜂胶类牙膏中加入5.0，50.0和100.0 μg/L低中高3种质量浓度的ChR标准溶液，按1.4节进行样品前处理，经LC-MS/MS法测定ChR的ME值分别为-3.8%，-1.7%和1.2%，这说明蜂胶类牙膏基质对LC-MS/MS法测定ChR不存在基质效应。

2.6 线性范围、相关系数、检出限及定量限

用不含待测物的空白基质溶液配制一系列ChR标准样品进行LC-MS/MS测定，以ChR质谱响应值（y）为纵坐标，ChR质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线；在不含目标物的空白基质牙膏中添加一系列低质量浓度的ChR标准溶液，平行测定20次，以信噪比S/N=3计算方法检出限（LODs），信噪比S/N=10计算方法定量限（LOQs）。结果显示：ChR在5.0～100.0 µg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=7.04×106x+3.16×105，相关系数（R2）为0.999 8；LODs为1.5 μg/kg，LOQ为5.0 μg/kg。

2.7 加标回收率和精密度

在3份不同的蜂胶类牙膏样品中分别添加5.0，50.0和100.0 μg/kg低中高3种浓度水平的ChR标准溶液进行加标回收率和精密度实验，结果见表1。从表1中可知，ChR在加标浓度5.0～100.0 μg/kg范围内，蜂胶类牙膏中ChR加标回收率测定值在86.7%～102.9%，平均回收率在93.0%～100.1%，相对标准偏差（RSD）在1.3%～3.4%。

表1 加标回收率和精密度（n=6）Tab.1 Recoveries and precision（n=6）

2.8 实际样品的测定

针对随即选购的8份不同品牌蜂胶类牙膏（新西兰Red seal红印蜂胶牙膏、德国Paul-dent宝儿德蜂胶牙膏、澳大利亚Healthy Care蜂胶牙膏、纽西小精灵蜂胶薄荷牙膏、高露洁蜂胶舒龈牙膏、纳诺神蜂蜂胶功效抑菌皓白牙膏、皓蓝蜂胶茶洁牙膏和CEDEL时达乐蜂胶牙膏）按本文所建LC-MS/MS法测定蜂胶类牙膏中ChR的含量。结果显示：8份受检蜂胶类牙膏中，7份样品检出含有ChR （见图3），ChR检出率共计87.5%；检出ChR的蜂胶类牙膏产品成分中均注明含有蜂胶提取物，功效主要为：清新口气、多重功效、牙龈护理、抗敏感，部分产品外包装上印有蜂巢图案，这说明所检市售蜂胶类牙膏中大部分生产商都通过添加蜂胶提取物来添加ChR，以达到清新口气、多重功效，符合QB/T 2966-2014《功效型牙膏》中功效型牙膏中添加的功效成分应进行定性或定量测定的要求。

图3 实际样品总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of actual samples

2.9 与现有检测方法的比较

从线性范围、加标回收率、相对标准偏差（RSD）、检出限和定量限等方法学参数，将本文所建LC-MS/MS法与现有标准、科学文献等报道的检测方法进行比较，结果见表2。从表2中可知，现有检测ChR的方法均具有较高的加标回收率和RSD；与HPLC法相比，质谱法（LC-MS或LC-MS/MS）的灵敏度更高；本文所建LC-MS/MS法具有加标回收率高、检出限低、精密度好等特点。

表2 不同检测方法的比较Tab.2 Comparison of different analysis methods

3 结论

建立了LC-MS/MS法测定蜂胶类牙膏中ChR含量的方法。结果表明，ChR在5.0～100.0 μg/L质量浓度范围内呈现良好的线性关系，相关系数（R2）为0.999 8；LODs为1.5 μg/kg，LOQ为5.0 μg/kg；平均加标回收率在93.0%～100.1%，相对标准偏差（RSD）在1.3%～3.4%。该法灵敏度高、准确度高、操作简便，可为功效型牙膏生产企业及其行政监管部门提供ChR检测方法。