三皮素对抗痤疮的功效研究

卢伊娜，王光寅，谢 红，谢智勇

（上海珈叶实业有限公司，上海 201100）

痤疮是毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病，主要好发于青少年，但随着现代生活方式和工作压力的变化，也逐渐多发于其他年龄层。现代医学认为，饮食、生活习惯、雄激素等诱导因素下，皮脂腺快速发育，皮脂合成及分泌增加，同时毛囊漏斗部角质细胞过度角化，导致厌氧性的痤疮丙酸杆菌大量繁殖，将皮脂中的甘油三酯分解成游离脂肪酸（FFA），而皮脂又在紫外线、污染物、金属离子等的作用下氧化成丙二醛、角鲨烯过氧化物等，这些代谢产物可进一步刺激细胞分泌炎性介质和细胞因子，导致炎症及异常免疫状态的发生，爆发粉刺、丘疹、脓疱、结节等多形性皮损[1-3]。因此，针对痤疮发生的多个机理如抑菌、控油、抗炎、抗角化等进行干预，是治疗痤疮的有效手段。

临床治疗痤疮主要是使用异维A酸、抗生素和抗雄激素类药物，容易产生副作用及耐药性。针对以粉刺、炎性丘疹为表现症状的寻常性痤疮，越来越多的公司开始寻求天然来源的活性成分，添加入化妆品作为日常使用的护肤品，来预防和治疗痤疮造成的皮损[3]。

《本草纲目》有云：“以骨入骨，以髓补髓，以皮治皮。”以皮治皮就是以动物或者植物的皮经过加工处理后作为药物使用来治疗皮肤相关疾病。本文前期筛选了30余种植物皮，发现倒捻子（Garcinia Mangostana）果皮、厚朴（Magnolia Officinalis）树皮、石榴（Punica Granatum）果皮有抑菌、抗炎等效果。本研究将这3种提取物通过特定的工艺进行复配，制备成三皮素溶液，体外验证其抗氧化及抑制痤疮丙酸杆菌的功效，再分别对皮脂腺细胞上的皮脂合成及其相关基因的mRNA表达水平、巨噬细胞上的炎症因子表达水平进行研究，来阐述三皮素对抗痤疮的作用，为其在个人护理领域中的进一步开发和应用提供依据。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

三皮素溶液（将倒捻子果皮、厚朴树皮、石榴果皮提取物按照一定比例复配溶解于60%的双丙甘醇而成），上海珈叶实业有限公司；卵磷脂、三氯化铁（FeCl3）、盐酸（HCl）、三氯乙酸（TCA）、2-硫代巴比妥酸（TBA）、抗坏血酸（Vc），国药集团化学试剂有限公司；痤疮丙酸杆菌（ATCC 11827）、梭菌增菌培养基，北京中科质检生物技术有限公司；人皮脂腺细胞（SZ95，货号BNCC338262，来源于ATCC）、小鼠巨噬细胞（Raw 264.7，ATCC TIB-71），北纳创联（苏州）有限公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素（PS）、PureLink 总RNA提取试剂盒、TaqMan 引物、TaqManRNA-to-CTTM一步法试剂盒，美国Thermo Fisher公司；油红O染液、多聚甲醛、噻唑蓝（MTT），美国Sigma公司；白介素6（ IL6）、前列腺素E2（ PGE2）、一氧化氮（NO）检测试剂盒，欣博盛生物科技有限公司。厌氧罐、厌氧产气袋，日本三菱化学株式会社；倒置显微镜及DC3000拍照软件，江南永新光学有限公司；MultiSkan FC酶标仪、Qubit核酸定量仪，美国Thermo Fisher公司；ABI 7500型实时荧光定量PCR仪，上海兽医研究所大仪器平台。

1.2 实验方法

1.2.1 体外脂质过氧化测定

参照文献[4]，将卵磷脂、FeCl3振荡溶解于磷酸缓冲液（PBS）配制成终浓度分别为10 g/L、4 mmol/L的溶液，于96孔板中依次加入100 μL卵磷脂溶液、35 μL FeCl3溶液，再加入15 μL用PBS稀释成不同质量分数的三皮素、Vc或溶剂，混匀后于37 ℃反应2 h，再加入100 μL配制好的TCA-TBA-HCl溶液，95 ℃水浴反应30 min，在酶标仪540 nm处检测吸光值（A）。抑制率=（1-A三皮素/A溶剂）×100%。

1.2.2 细胞内脂质含量测定

细胞内皮脂含量的测定采用油红O法[5]。将用含10% FBS、1% PS的DMEM培养基培养至指数增长期的SZ95细胞以3×104/孔接种于96孔板中，培养24 h后分别加入质量分数为0.1%和0.3%的三皮素或溶剂，于37 ℃继续孵育24 h。弃去DMEM培养基，加入200 μL 4%的多聚甲醛溶液，室温固定30 min后，弃去多余溶液，再加入0.5%的油红O溶液（异丙醇溶解），在室温下染色15 min。弃掉多余染色液，PBS轻洗2次，镜检观察后拍照，分析其脂质含量及细胞形态。细胞活力用MTT法检测[5，6]。

1.2.3 基因表达检测

将SZ95细胞以2×106/孔接种于12孔板中培养24 h，之后加入质量分数为0.1%的三皮素或溶剂继续孵育24 h。利用PureLink®总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，测定核酸浓度及完整性，再以500 ng总RNA为模板，按照TaqMan®RNA-to-CT™一步法试剂盒所提供的方法，于ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上检测实时荧光值（CT）。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，根据相对定量法（2-ΔΔCT）分别计算靶标基因肾上腺素受体（AR）、胰岛素样受体（IGF1R）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）、Toll样受体2 （TLR2）的相对表达量[7,8]。-ΔΔCT=（CT靶标基因-CTGAPDH）三皮素-（CT靶标基因-CTGAPDH）溶剂。

1.2.4 体外痤疮丙酸杆菌最低抑菌浓度（MIC）测定

参照文献[9]，将活化好的痤疮丙酸杆菌于酶标仪620 nm处测定吸光值（A），计算其菌液浓度后，用梭菌增强培养基稀释至1×106CFU/mL。于96孔板中依次加入20 μL用PBS稀释成不同质量分数的三皮素或溶剂、180 μL稀释菌液，37 ℃恒温厌氧培养48 h后，取出细菌培养板，室温振荡5 min，检测吸光值（A），抑制率的计算公式同前所述。同时肉眼观察培养基的澄清度，并取200 μL进行平板涂布，厌氧培养48 h后无菌生长的最低浓度即为MIC。

1.2.5 炎症因子表达量检测

参照文献[10]，将用含10% FBS、1% PS的DMEM培养基培养至指数增长期的Raw 264.7细胞以5×104/孔接种于96孔板中培养24 h，弃去培养液后再加入180 μL用培养基稀释成不同质量分数的三皮素或溶剂，加入或不加入20 μL痤疮丙酸杆菌（初始浓度为5×108CFU/mL，于85 ℃灭活30 min），于37 ℃继续孵育24 h。下层细胞用MTT法检测细胞活力[6,10]，上层培养液收集至96孔板中，按照ELISA试剂盒的说明书分别检测NO、IL6和PGE2的表达量（C）[11]，抑制率=（1-C三皮素/C痤疮丙酸杆菌）×100%。

1.2.6 数据分析

采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析。P＜0.05认定为差异显著，以“*”标记；P＜0.01认定为差异极其显著，以“**”标记。

表1 三皮素对脂质过氧化的抑制作用Tab.1 Inhibitory action of GMP on lipid peroxidation

2 结果与讨论

2.1 三皮素抑制脂质过氧化

脂质过氧化导致的脂质成分改变参与了痤疮的发生与发展[12]。高价金属离子如Cu2+、Fe3+等可诱导卵磷脂发生过氧化反应，生成丙二醛（MDA），TBA可与MDA反应生成粉红色络合物，在532 nm处有最大光吸收，因此，采用TBA反应可定量检测脂质过氧化发生率[4]。表1为三皮素对脂质过氧化的抑制作用。由表1可知，FeCl3可使A值增加至1.108，促进了MDA的生成，而三皮素可剂量依赖性地抑制脂质过氧化，在质量分数为1%时，抑制率达到46.44% （**，与溶剂组相比），为同等浓度下Vc的0.5倍。

2.2 三皮素降低SZ95细胞内脂质含量

人皮脂腺细胞大量分泌脂质是发生痤疮的前提条件[1,2]。皮脂腺细胞的活性受受体的配体调节，例如AR、IGF1R、PPARs、神经肽受体、TLRs等[2,12]。雄激素、IGF1、PPAR激动剂、胰岛素等通过与其相应受体结合，激活信号通路，诱导脂质和类固醇的生成[12]。

图1 三皮素对SZ95细胞形态及细胞内脂质含量的影响（100×）Fig.1 The effects of GMP on cell morphology and sebum content in SZ95 cells （100×）

三皮素处理SZ95细胞24 h后，未染色前（图1a～c），0.3%的三皮素处理组使细胞形态变圆变小，且有部分细胞破碎，皮脂分泌至培养基中。油红O染色后（图1d～f），0.3%的三皮素处理组细胞内脂滴较溶剂组少，且脂滴变大，表明细胞处于终端分化[13，14]；MTT结果显示0.1%的三皮素处理组的细胞活力达到95.61%，细胞内脂滴的形态也无明显变化，但脂滴量明显变少，说明三皮素可减少脂质合成。

2.3 三皮素下调IGF1R和PPARγ的表达

脂质合成受很多信号通路的调控[2]。通过研究三皮素对SZ95细胞上AR、IGF1R、PPARγ、TLR2的mRNA表达水平的影响发现，0.1%的三皮素处理组相比于溶剂组可使IGF1R和PPARγ的mRNA表达量下降至0.68和0.84（图2），而AR和TLR2受体表达量太低未检测出，说明三皮素可通过下调IGF1R和PPARγ的表达量来减少皮脂合成。

图2 三皮素下调IGF1R和PPARγ的mRNA表达Fig.2 Th e mRNA expression levels of IGF1R and PPARγ down-regulated by GMP

2.4 三皮素抑制痤疮丙酸杆菌生长

痤疮丙酸杆菌是与痤疮发生密切相关的细菌之一[15]。图3的体外抑菌试验结果表明，质量分数为0.01%～1%的三皮素剂量依赖性地抑制痤疮丙酸杆菌的生长，在三皮素质量分数为0.03%时抑制率即达到95.84% （**，与溶剂组相比），肉眼观察培养基为澄清，平板涂布培养后无菌生长，因此，三皮素对痤疮丙酸杆菌的MIC为0.03%。

图3 三皮素对痤疮丙酸杆菌生长的抑制作用Fig.3 In hibitory action of GMP on the growth of Propionibacterium acnes

2.5 三皮素抑制炎症因子表达

痤疮丙酸杆菌在痤疮的发病中主要作用是诱导机体免疫反应和局部炎症的发生，同时它也参与毛囊导管上皮的过度角化[16]。痤疮丙酸杆菌可刺激细胞分泌多种炎性介质和细胞因子，导致炎症及异常免疫状态的发生，从而加重皮肤炎症及痤疮类型[16,17]。

表2为痤疮丙酸杆菌诱导的炎症因子表达量的变化。由表2可知，痤疮丙酸杆菌诱导Raw 264.7细胞后检测炎症因子的表达量发现，NO的表达量从0.06 μmol/L升至9.58 μmol/L （**，与未刺激组相比），IL6和PGE2的表达量也升高了13倍以上，说明痤疮丙酸杆菌可诱导细胞产生炎症。

表2 痤疮丙酸杆菌诱导炎症因子的表达Tab.2 The expression of cytokines induced by Propionibacterium acnes

同时检测三皮素对痤疮丙酸杆菌诱导的Raw 264.7细胞炎症因子表达的作用，MTT结果显示0.1%三皮素处理组的细胞活力达到91.55%；炎症因子抑制率的结果表明（图4），质量分数为0.003%～0.1%三皮素剂量依赖性地抑制了NO、IL6和PGE2的表达，其抑制率在0.1%时均达到90%以上（**，与痤疮丙酸杆菌组相比），显示出良好的抗炎效果。

图4 三皮素对痤疮丙酸杆菌诱导炎症因子的抑制作用Fig.4 In hibitory action of GMP on cytokines induced by Propionibacterium acnes

3 结论

1）三皮素可抑制脂质过氧化，并通过下调IGF1R和PPARγ的mRNA表达量来减少皮脂腺细胞内的皮脂合成。

2）三皮素抑制痤疮丙酸杆菌生长，显著降低痤疮丙酸杆菌诱导的巨噬细胞NO、IL6和PGE2炎症因子的表达量，来达到抗炎的效果。

3）作为一种来源于3种植物皮的复配型植物提取物，三皮素可添加入化妆品中，发挥其抗炎、抑菌、抑制脂质合成的作用，来对抗寻常性痤疮。