响应面法优化近江牡蛎多糖多肽联产的酶解工艺

杨大俏,王锦旭,李来好,*,杨贤庆,马海霞

(1.中国水产科学研究院南海水产研究所,农业农村部水产品加工重点实验室,广东省渔业生态环境重点开放实验室,广东广州 510300;2.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

牡蛎俗称蚝或海蛎子,肉质鲜美可口而受到人们喜爱,具有很高的药用价值[1-2],并且含有丰富的蛋白质[2]和碳水化合物,因其锌含量极高,富含铁、钙等元素,素有“海洋牛奶”的称号[3]。中国拥有丰富的海洋资源,2016年中国牡蛎行业产量达到483.5万吨[4],是中国一种重要经济贝类,但是,目前中国对牡蛎产品除直接食用外,大多通过简单加工直接进入食品市场,产品附加值不高[5],牡蛎产业发展受到制约。研究生物活性物质是海洋研究的主导方向[6],相关研究报道显示,牡蛎多糖具有多种药用功能,对牡蛎多糖的深入研究有利于制药、功能食品及膳食补充剂等行业的发展[7-8]。天然海洋活性多肽具有较高的稳定性[9],但是海洋鱼虾贝类中的生物活性肽的研究尚处于实验室阶段[7-10]。

目前已有关于牡蛎多糖或牡蛎多肽[11]的提取工艺研究,多采用碱提取法[12]和蛋白酶水解法[13-14],但该类研究多集中在单独提取多糖分子或单独提取多肽分子上,关于牡蛎多糖活性分子和多肽活性分子联产工艺并未见报道。联产[15-16]制备技术是指利用物理或化学方法同时提取物料中多种有效成分的高效、洁净利用的生产技术。关于几种物质同时提取或联产制备的研究,国内主要集中于油料作物和中草药活性成分的提取方面,对海洋生物资源尤其是关于高效利用牡蛎的工艺研究还比较少,国外研究在这一方面几乎还是盲点。本研究旨在得到同时提取近江牡蛎(Ostrearivularis)中功能多糖和活性多肽的工艺,实现近江牡蛎多糖和多肽的联产制备,以提高近江牡蛎利用率。

本实验以近江牡蛎为原料,采用单因素试验研究了酶解时间、酶配比及料液比对多糖[17]多肽联产的影响,在此基础上进一步通过响应面法分析了各因素及其交互作用对多肽含量、酸性糖含量及总糖含量的影响,并最终得到最优多糖多肽的联产工艺条件,以期为连续膜分离联产制备近江牡蛎多糖及多肽的中试化放大生产提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

近江牡蛎全脏器(于-20 ℃冷冻保藏备用) 广东省台山市;Alcalase酶(210 AU·mg-1)、胰蛋白酶(≥250 U·mg-1)、中性蛋白酶(≥100 U·mg-1) 广州齐云生物技术有限公司;硫酸软骨素、甘氨酸、氯化钠、氢氧化钠、葡萄糖、无水乙醇、三氯乙酸、苯酚、无水硫酸铜、甲醛、盐酸、浓硫酸(均为分析纯) 广州佳研生物科技有限公司;1,9-二甲基亚甲基蓝、Gly-Gly-Tyr-Arg(标准品) 美国Sigma公司。

JYL-C022E料理机 九阳股份有限公司;T50均质机 德国IKA;ZDJ-4A雷磁自动电位滴定仪 上海仪电科学仪器股份有限公司;Sunrise-basic Tacan吸光酶标仪 瑞士TECAN;三联高压平板膜设备 厦门福美科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 联产提取工艺 近江牡蛎全脏器→匀浆→均质10 min→热水浸提→调pH8.0→酶解→煮沸灭酶→离心→上清液调pH7.0→0.22 μm滤膜除杂→200 kDa膜分离→收集滤过液与截留液→滤过液经8 kDa膜分离[18]→收集8 kDa以下滤过液(粗多肽)、8 kDa以上截留液(粗多糖)→冻干得粗多肽、粗多糖。

1.2.1.1 热水浸提 将牡蛎匀浆与水混匀后在55 ℃水浴0.5 h。

1.2.1.2 离心 将经过煮沸灭酶后的牡蛎酶解液在9000 r·min-1离心10 min。

1.2.1.3 0.22 μm微滤微滤条件 操作压力为0.12 MPa,操作温度为10 ℃。

1.2.1.4 8 kDa膜分离超滤条件 操作压力为1.05 MPa,操作温度为10 ℃。

1.2.1.5 200 kDa膜分离超滤条件 操作压力为0.5 MPa,操作温度为10 ℃。

1.2.1.6 冻干 旋转蒸发温度为55 ℃。

1.2.2 酶种类及添加量的选择 以近江牡蛎全脏器为原料,匀浆均质、热水浸提后分别按照质量分数200、400、600、800、1000 mg·L-1(0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%)的添加量添加Alcalase酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三种酶,在55 ℃、pH8.0的条件下单酶酶解2.0 h,酶解液在9000 r·min-1离心10 min,调酶解液上清液pH至中性,测定水解度、多肽含量、酸性糖含量和总糖含量。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及总糖含量的极大值为指标,判定最佳酶解条件。

1.2.3 近江牡蛎肉多糖多肽联产工艺的单因素实验

1.2.3.1 酶解时间对近江牡蛎肉多糖多肽联产工艺影响 取50.0 g近江牡蛎全脏器匀浆均质后,加入150 mL去离子水,于55 ℃热水浸提0.5 h,调节pH至8.0,加入配比为3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(总质量分数为0.8%),在55 ℃下分别酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。酶解后煮沸灭酶,离心取适量上清液测量水解度以及多肽含量,调节pH至7.0,加入无水乙醇至终体积分数为65%,4 ℃醇沉24 h,过滤取沉淀,丙酮洗涤三次,干燥后配制成溶液检测酸性糖含量以及总糖含量。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及总糖含量的极大值为指标,判定最佳酶解时间。

1.2.3.2 双酶配比对近江牡蛎肉多糖多肽联产工艺影响 在酶解时间为2.0 h,料液比为1∶3的情况下,加入总添加质量分数为0.8%的Alcalase与胰蛋白酶,配比分别为4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及总糖含量的极大值为指标,判定最佳双酶配比。

1.2.3.3 料液比对近江牡蛎肉多糖多肽联产工艺影响 在酶解时间为2.0 h,配比为3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(总质量分数为0.8%)情况下,分别按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 (g/mL)的料液比添加去离子水。以酶解液中多肽含量、酸性糖含量及总糖含量的极大值为指标,判定最佳料液比。

1.2.4 响应面法优化近江牡蛎肉多糖多肽联产工艺 通过单因素实验[19-21]确定选取酶解时间A、双酶配比B、料液比C作为三因素进行编码[28],以多肽含量、酸性糖含量和总糖含量作为响应值,实验因素和水平设计见表1。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.5 指标测定 多肽的含量采用三氯乙酸沉淀法[22];水解度的测定依照甲醛滴定法[23-24];总糖含量采用苯酚-硫酸法[25];酸性糖含量的测定采用1,9-二甲基亚甲基蓝法[26-27]。其中多肽、总糖、酸性糖含量以mg·50 g-1计。

1.3 数据分析

以上实验均经过三次重复操作,采用IBM SPSS Statistics 20.0对数据进行统计分析,运用单因素方差分析(ANOVA)检测平均值显著性,其中*代表差异显著(p<0.05),**代表差异极显著(p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 酶种类及添加量的选择

由图1可知,随着3种酶添加量的增加,牡蛎酶解液的水解度升高,且Alcalase水解效果最佳;整体而言,在一定添加量下,Alcalase与胰蛋白酶酶解牡蛎匀浆得到的多肽含量较高;对于酸性糖等大分子物质,胰蛋白酶的酶解效果远远大于其它2种酶,中性蛋白酶的酶解效果最差;通过总糖含量结果显示,Alcalase与胰蛋白酶的酶解效果较好。综上,选择Alcalase与胰蛋白酶共同酶解牡蛎匀浆,以期同时得到所需的多糖多肽。

图1 3种酶不同添加量对近江牡蛎匀浆水解度(a)、多肽含量(b)、酸性糖含量(c)以及总糖含量(d)的影响Fig.1 The effects of three enzymes on the degree of hydrolysis(a),polypeptide content(b),glycosaminoglycan content(c)and total-sugar content(d) of Ostrea rivularis

2.2 单因素实验结果

2.2.1 酶解时间对近江牡蛎多糖多肽联产的影响 结果见图2,随酶解时间的延长,水解度逐渐升高,但各数值间差异不明显;多肽含量、酸性糖含量以及总糖含量随酶解时间延长均出现先增加后下降的趋势,并在酶解时间2.0 h达到最大值,故最适酶解时间为2.0 h。

图2 不同酶解时间对近江牡蛎多糖多肽联产的影响Fig.2 Effects of different hydrolysis time on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.2.2 双酶配比对近江牡蛎多糖多肽联产的影响 结果见图3,水解度随Alcalase酶含量的升高逐渐升高,各数值间差异不明显;多肽含量、酸性糖含量以及总糖含量随Alcalase与胰蛋白酶比例变化趋势一致,并在Alcalase与胰蛋白酶添加比例为3∶1时达到最大值,故最适双酶配比为Alcalase∶胰蛋白酶=3∶1(总添加质量分数0.8%)。

图3 酶配比对近江牡蛎多糖多肽联产的影响Fig.3 Effects of different proportion of enzymes on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.2.3 料液比对近江牡蛎多糖多肽联产的影响 结果如图4所示,随料液比的增大,水解度差异不明显;多肽含量、酸性糖含量和总糖含量随料液比的增大呈现出先增加后减小的趋势,并在料液比1∶3 g/mL时达到最大值,故选择最佳料液比为1∶3 g/mL 。

图4 料液比对近江牡蛎多糖多肽联产的影响Fig.4 Effects of different solid-liquid ratios on co-production of polysaccharides and polypeptides simultaneously from Ostrea rivularis

2.3 响应面试验结果

由图2～图4可知,在不同酶解时间、双酶配比、料液比下,近江牡蛎酶解液的水解度变化差异不明显,故而在单因素实验的基础上,根据Box-Benhken的中心组合实验设计原理,选取酶解时间A、双酶配比B、料液比C作为三因素,并以具有显著性差异的多肽含量Y1、酸性糖含量Y2和总糖含量Y3作为响应值,实验方案及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface experiment

运用Design Expert 8.0软件对实验结果进行回归拟合,得到的回归方程如下:

为检验上述方程的有效性,运用Design Expert 8.0.6软件对上述结果进行数据分析,可信度分析见表3,方差分析结果见表4。三种响应值的可信度分析的模型相关系数R2分别为0.9352、0.9615、0.9638,都接近于1,表示模型相关度很好;变异系数(C.V.%)分别为8.68、5.39、6.39,说明该数学模型的置信度较好,该模型可以较好地反应试验的真实值[18]。由表4可知,对于多肽含量、酸性糖含量和总糖含量三个响应值,该模型的F值分别为11.23、19.45、20.72,p值分别为0.0022、0.0004、0.0003均小于0.05,可以判断模型是显著的;同时三个响应值的模型失拟项p值均大于0.05,说明模型失拟项不显著。综上所述,该回归模型对三个响应值的拟合程度较好,实验误差小。

表4 回归方程的方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of regression equation

表3 模型的可信度分析Table 3 Reliability analysis of model

料液比对多肽的提取影响极显著(p<0.01),双酶配比和料液比对酸性糖的提取具有极显著的影响(p<0.01),料液比对总糖提取的影响显著(p<0.05),且该实验中三个单因素对近江牡蛎肉多肽含量、酸性糖含量、总糖含量影响的排序分别为料液比>酶解时间>双酶配比、双酶配比>料液比>酶解时间、料液比>酶配比>酶解时间。

利用此模型可拟合出三个响应值相应的响应面分析图,响应面三维图形是响应值对试验因子(单因素变量)所构成的三维空间曲面图,可以进一步研究各个变量间的交互作用并确定最优点[20]。当特征值(响应值)变化,三维响应面分析图呈现相应变化[21]。图5a表示酶解时间与酶配比交互作用对多肽提取的影响,随着酶解时间和胰蛋白酶添加比例增加,多肽含量变化不大,呈现轻微增加趋势,但其交互作用不显著;图5b表示酶解时间和料液比交互作用对多肽提取的影响,随着酶解时间和料液比的增加,多肽含量呈现先增加后降低的趋势,而且随着料液比的增加,多肽含量增加显著且下降趋势不明显,以此判断料液比的对多肽提取的影响显著高于酶解时间,但其交互作用不显著;图5c表示酶配比和料液比交互作用对多肽提取的影响,随着胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,多肽含量先增加后降低,并且料液比的对多肽提取的影响高于酶配比对多肽提取的影响,但其交互作用不显著。

图5 酶解时间、酶配比和料液比两两交互作用对近江牡蛎多肽提取的影响Fig.5 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of polypeptides from Ostrea rivularis注:a:酶解时间与酶配比的交互作用;b:酶解时间和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

图6a为酶解时间与酶配比的交互作用对酸性糖提取的影响,随着酶解时间和胰蛋白酶添加比例增加,酸性糖含量增加,但是胰蛋白酶添加比例对酸性糖提取的影响明显大于酶解时间对酸性糖提取的影响,这与单因素实验得到的结论一致,但两者交互作用不显著;图6b表示酶解时间和料液比交互作用对酸性糖提取的影响,随着酶解时间和料液比的增加,酸性糖含量呈现轻微增加趋势,两者交互作用不显著;图6c表示酶配比和料液比交互作用对酸性糖提取的影响,随着胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,酸性糖含量同样先增加后降低,料液比的影响不显著,两者交互作用不显著。综合图6可以看出,三种因素对酸性糖提取影响的交互作用均不显著。

图6 酶解时间、酶配比和料液比两两交互作用对近江牡蛎酸性糖提取的影响Fig.6 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of glycosaminoglycan from Ostrea rivularis注:a:酶解时间与酶配比的交互作用;b:酶解时间和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

图7a为酶解时间与酶配比的交互作用对总糖提取的影响,随着酶解时间和胰蛋白酶添加比例增加,酸性糖含量先增加后减少,两者交互作用不显著;图7b表示酶解时间和料液比交互作用对总糖提取的影响,随着酶解时间和料液比的增加,总含量呈现先增加后降低的趋势,但两者交互作用不显著;图7c表示酶配比和料液比交互作用对总糖提取的影响,随着胰蛋白酶添加比例和料液比的增加,总糖含量先增加后降低,两者交互作用不显著。

图7 酶解时间、酶配比和料液比两两交互作用对近江牡蛎总糖提取的影响Fig.7 The effects of hydrolysis time,enzymolysis proportion and liquid-solid ratio on the extraction of total-sugar from Ostrea rivularis注:a:酶解时间与酶配比的交互作用;b:酶解时间和料液比的交互作用;c:酶配比和料液比的交互作用。

以多肽含量、酸性糖含量以及总糖含量为响应值,经Design Expert 8.0.6软件分析可得最佳工艺条件为酶解2.05 h,添加配比为2.9∶1.1的Alcalase和胰蛋白酶(总质量分数为0.8%),料液比1∶3.65 g/mL,相应的响应面二次模型预测多肽含量最大值为251.10 mg·50 g-1,酸性糖含量最大值为8.57 mg·50 g-1,总糖含量最大值为388.00 mg·50 g-1,三种响应值均为该最佳工艺条件下的最大值。为了验证该实验响应面法的可行性,考虑到实际操作问题,选取最佳提取工艺为酶解2.0 h,添加配比为3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(总质量分数为0.8%),料液比1∶3.6 g·mL-1,重复三次实验得到近江牡蛎酶解液中多肽含量(251.70±5.73) mg·50 g-1,酸性糖含量(8.17±0.29) mg·50 g-1,总糖含量(380.66±15.14) mg·50 g-1,与回归方程预测值相近,说明近江牡蛎多糖多肽联产工艺是可行的,并在此条件开展以下实验。

取500.00 g近江牡蛎匀浆,按照所得最佳工艺酶解近江牡蛎,经过超滤膜分离酶解上清液,得粗多糖制品和粗多肽制品,重复3次试验得,粗多糖冻干品(21.25±0.60) g,得率为21.29%±0.77%,含85.18%±1.00%总糖,20.02%±0.38%酸性糖以及10.84%±0.12%多肽;粗多肽冻干品(31.88±0.71) g,得率为31.41%±0.47%,含84.03%±0.85%多肽,0.11%±0.01%酸性糖以及5.68%±0.15%总糖。

另外,经过8 kDa超滤膜超滤分离后,使用三氯乙酸沉淀法、苯酚-硫酸法、1,9-二甲基亚甲基蓝法测定各浓缩冻干粉,其颜色反应证实8 kDa超滤膜分离效果良好,可用于近江牡蛎多糖多肽联产工艺。

3 结论

近江牡蛎多糖多肽联产的最优酶解工艺为料液比1∶3.6 g·mL-1,添加配比为3∶1的Alcalase和胰蛋白酶(总质量分数为0.8%),酶解2.0 h。此条件下近江牡蛎酶解液中多肽含量(251.70±5.73) mg·50 g-1,酸性糖含量(8.17±0.29) mg·50 g-1,总糖含量(380.66±15.14) mg·50 g-1。并按此工艺酶解近江牡蛎全脏器匀浆,得粗多糖21.29%±0.77%,含85.18%±1.00%总糖,20.02%±0.38%酸性糖以及10.84%±0.12%多肽;粗多肽得率为31.41±0.47%,含84.03%±0.85%多肽,0.11%±0.01%酸性糖以及5.68%±0.15%总糖。与回归方程预测值相近,说明近江牡蛎多糖多肽联产工艺是可行的,能够同时且最大化地得到近江牡蛎多糖与多肽。