发芽糙米中粗多糖的纯化及分子量测定

刘晓飞,张 宇,王 薇,关桦楠,张 娜,马永强,*,卢淑雯

(1.哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江哈尔滨 150076;2.黑龙江省农业科学院博士后科研工作站,黑龙江哈尔滨 150086)

糙米是稻谷脱去外保护皮层稻壳后的颖果,发芽糙米是糙米经过适宜的水分、温度等外界条件发芽所得[1]。发芽糙米主要由幼芽和带皮层的胚乳两个部分构成[2]。发芽糙米不仅有较高的营养价值,在不同的方面也有着各种功效[3-4]。发芽糙米与糙米相比,不但感官性能和风味得以改善,而且在保留了丰富的维生素、矿物质、膳食纤维营养成分的同时,更是产生了多种具有促进人体健康和防治疾病的成分,如γ-氨基丁酸、六磷酸肌醇等[5],营养价值大大提高[6]。发芽糙米中有更多的人体所需营养成分和生理活性成分种类,具有明显的生理活性优势[7],因此需要更深入研究。

但是,目前对发芽糙米的研究主要集中在发芽的工艺研究、发芽糙米中淀粉的改性以及发芽糙米为原料的各种食品制作上,对发芽糙米中γ-氨基丁酸、膳食纤维、γ-谷维素等相关的研究比较多,而对其中多糖类物质研究较少[8-9]。多糖的纯化过程及方法与多糖的活性具有很密切的相关性,从植物中提取的粗多糖一般都含有非多糖杂质[10]。因此需要对提取的粗多糖进行除杂,对不同的除杂方法进行筛选,筛选的原则是不仅要去除杂质的效果好,更为重要的是避免除杂方法对多糖结构和生物活性造成破坏,因此对提取出的粗多糖初步纯化脱色和脱蛋白质方法上的筛选是多糖纯化的重要步骤。虽然有关植物粗多糖的纯化分离的研究有很多,但还没有针对于发芽糙米粗多糖的高效的纯化和分离方法。

汪艳群等[11]发现酶与三氯乙酸-正丁醇结合法比传统单一的脱蛋白方法去除蛋白的效果更好。欧文等[12]发现Sevag法对荠菜粗多糖中的蛋白去除效果更好。从植物中提取出的粗多糖中经常含有一些色素,色素的存在会影响多糖的结构和性质的分析鉴定[13-14]。实验室经常用活性炭、硅藻土、大孔吸附树脂等吸附法进行脱色[15-16]。付学鹏等[17]比较了活性炭、过氧化氢等几种脱色方法对植物粗多糖脱色的原理以及优缺点。因为活性炭等吸附剂疏松多孔的结构且无选择性,采用吸附剂吸附脱色会使较多的多糖损失[18]。树脂吸附是更高效的脱色方法,夏玮等[19]采用了五种不同型号的大孔树脂对桑叶粗多糖溶液进行脱色处理,以脱色率和多糖损失率为测量指标,分析出AB-8型号大孔吸附树脂对桑叶粗多糖的脱色效果最好。

本实验以脱蛋白率、脱色率和粗多糖损失率为评价指标,选出发芽糙米粗多糖脱色和脱蛋白的最佳方法,然后对经脱色脱蛋白后的发芽糙米粗多糖进行柱层析,比较三种柱层析填料对发芽糙米粗多糖的层析效果,筛选出最优柱层析填料,对柱层析后的发芽糙米多糖各组分进行分子量的测定，以期为发芽糙米粗多糖的提取、纯化及分离提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粳稻为“龙粳” 产地:黑龙江,黑审稻2011004;纤维素酶(4万U/g)、木瓜蛋白酶(4万U/g)、果胶酶(4万U/g) 上海生化试剂厂;柠檬酸、磷酸氢二钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、浓硫酸 均为分析纯,北京博奥拓达科技有限公司;DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Fast Flow、DEAE Cellulose 52、Sepharose CL-6B、Sephadex G50 Pharmacia公司。

JY92-9C型微波仪 宁波新知生物科技股份有限公司;HHS-12型电热恒温水浴锅 上海东星建材实验设备有限公司;721E型紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;BS224S型电子分析天平 塞多利斯科学仪器有限公司;M288479型高速万能粉碎机 北京东方德教育科技有限公司;TGL-16G-B型台式高速离心机 闽南星科科学仪器有限公司；SHZ-C水浴振荡箱 上海昨非实验室设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发芽糙米粗多糖的制备 用龚谷机去除稻子外壳得到糙米,在4 ℃避光条件下储藏。用灭菌水浸泡糙米12 h,平铺于托盘中,置于20 ℃的培养箱发芽24 h,将发芽糙米放于85 ℃恒温干燥箱中灭酶处理40 min,然后55 ℃干燥24 h,粉碎过筛(80目)备用。按料液体积比1∶30加入蒸馏水,100 W超声60 min,再放入80 ℃水浴振荡箱中震荡4 h,在20 ℃条件下4000 r/min、离心10 min后过滤收集上清液,按1∶3加入80%～85%的乙醇,放置24 h,在20 ℃条件下8000 r/min离心15 min,收集沉淀,冷冻干燥(-25 ℃,8 h)得发芽糙米粗多糖[20]。

1.2.2 发芽糙米多糖及蛋白质的测定 采用苯酚-硫酸法[21]测定发芽糙米多糖的含量,制作葡萄糖标准曲线。将样品准确稀释合适的倍数,吸取2 mL样品溶液,分别加入1 mL的6%苯酚、5 mL浓硫酸,490 nm下测量其吸光度值,代入葡萄糖标准曲线方程,计算糖含量。

采用考马斯亮蓝法[22]测定发芽糙米多糖蛋白质的含量,制作牛血清蛋白标准曲线。吸取1 mL样品溶液,精密吸取考马斯亮蓝溶液5 mL,振荡均匀,静置2 min后于595 nm处测定吸光度值,代入牛血清蛋白标准曲线方程,计算蛋白质含量。

1.2.3 发芽糙米粗多糖脱蛋白方法的筛选 采用三种脱蛋白的方法对发芽糙米粗多糖进行脱蛋白,分别多次实验,比较脱蛋白效果,得到脱蛋白三种方法最为稳定的次数。

1.2.3.1 Sevage法脱蛋白 精确配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,加入其体积比1∶5的三氯甲烷-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,振摇30 min,在20 ℃条件下8000 r/min离心10 min,上清液再加入粗多糖溶液1/5体积的三氯甲院-正丁醇(4∶1,v/v)溶液,多次重复相同脱蛋白实验步骤,直到无沉淀产生[23]。根据1.2.5计算公式计算Sevage法的粗多糖脱蛋白率、粗多糖损失率。

1.2.3.2 三氯乙酸法脱蛋白 精确配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,将20%的三氯乙酸和粗多糖溶液1∶1混合,振摇30 min后,冰箱放置过夜,在20 ℃条件下8000 r/min离心10 min离心,取上清液,用1 mg·mL-1氢氧化钠溶液调至中性[24],根据1.2.5计算公式计算三氯乙酸法的多糖脱蛋白率、粗多糖损失率。

1.2.3.3 酶-Sevage法脱蛋白 精确配制10 mg·mL-1的粗多糖溶液,调pH为6,加入粗多糖溶液体积2%的木瓜蛋白酶,在水浴温度37 ℃酶解24 h,反应完全后从37 ℃ 3 min加热升温至80 ℃使酶失活,在20 ℃条件下8000 r/min离心10 min离心,上清液经Sevage法脱蛋白,反复多次,直到无明显的蛋白产生为止[25],根据1.2.5计算公式计算酶-Sevage法的多糖脱蛋白率、粗多糖损失率。

1.2.4 发芽糙米粗多糖脱色方法的筛选

1.2.4.1 活性炭吸附法脱色 活性炭经重蒸水清洗过滤,干燥(120 ℃,8 h)冷却备用。取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,加入1.5%的活性炭,置于恒温45 ℃下脱色2 h,脱色可反复进行,直至颜色澄清透明或吸光值不再变化,检测其粗多糖含量[26],根据1.2.5计算公式计算活性炭法粗多糖的脱色率、粗多糖损失率。

1.2.4.2 过氧化氢氧化法脱色 取粗多糖配制成2 mg·mL-1的粗多糖溶液30 mL,用氨水调节pH至9,加入l mL、30%的H2O2,恒温45 ℃下脱色6 h,脱色可反复进行,直至颜色澄清透明或吸光值不再变化[27],根据1.2.5计算公式计算过氧化氢氧化法粗多糖的脱色率、粗多糖损失率。

1.2.4.3 大孔树脂吸附法脱色 由于发芽糙米粗多糖为弱极性,所以本研究选用AB-8大孔树脂。精密称取经预处理的优选树脂20 mL,湿法装柱,柱下端塞入脱脂棉并压平,待柱内树脂稳定后,将4 BV的2 mg·mL-1的粗多糖溶液以2 BV的速度进行脱色,待样品液完全进入柱内后,用2倍上样体积的蒸馏水进行冲洗,收集脱色后液浓缩至上样体积[28],测定并根据1.2.5计算公式计算大孔树脂吸附法粗多糖的脱色率、粗多糖损失率。

1.2.5 发芽糙米粗多糖提取率、脱色率、脱蛋白率和损失率的计算

粗多糖提取率(%)=(粗提液中总糖含量(mg/mL)×粗提液总体积(mL))/发芽糙米粉末质量(mg)×100

粗多糖脱色率(%)=(脱色前A400-脱色后A400)/脱色前A400×100

粗多糖脱蛋白率(%)=(脱蛋白前A595-脱蛋白后A595)/脱蛋白前A595×100

粗多糖损失率(%)=(脱蛋白(脱色)前多糖A490-脱蛋白(脱色)后A490)/脱蛋白(脱色)前A490

1.2.6 发芽糙米粗多糖层析纯化三种填料的筛选 将溶胀好的凝胶DEAE-Sepharose 52取出后,加水与凝胶体积比例为1∶3,搅拌混匀凝胶后,35 ℃,30 kHz超声10 min去除气泡,湿法装柱(Φ26 mm×300 mm),用水洗脱过夜[29]。将粗多糖样品溶解在蒸馏水中,将其配为浓度为20 mg/mL多糖溶液,在20 ℃条件下用离心机8000 r/min离心10 min,取4 mL上清液上样,流速换成5 mL/min,每管收集5 mL,用蒸馏水洗脱收集30管后,再用0.1、0.2、0.3 mol/L的NaCl分别进行梯度洗脱,每个梯度依次接收30管,用苯酚-硫酸跟踪检测含糖管A490,做出梯度洗脱曲线,对发芽糙米进行层析纯化[30]。按照洗脱曲线收集各个主峰,Sephadax G50脱盐柱进行脱盐,采用旋转蒸发仪,80 ℃,50 r/min,浓缩至1/3体积后真空冷冻、-60 ℃,12 h干燥备用。

相同实验步骤操作DEAE-Sepharose Cl-6B、DEAE Fast Flow这两种填料,通过洗脱曲线比较哪种填料的层析效果好。选择实验效果好的填料作为后续实验柱层析的填料对发芽糙米进行层析纯化。按照洗脱曲线收集各个主峰,Sephadax G50脱盐柱进行脱盐,浓缩后真空冷冻干燥(-60 ℃,12 h)备用。

1.2.7 发芽糙米多糖纯度鉴定及其分子量的测定

1.2.7.1 紫外光谱分析 称取适量经纯化的各个组分多糖样品,配制成浓度为1 mg/mL的溶液,把去离子水作为对比,在600～150 nm处做全波长扫描检测[31]。

1.2.7.2 高效凝胶过滤色谱(HPGPC)测定分子量 准确称量经柱层析分离纯化后的发芽糙米水洗多糖和盐洗多糖各 1 mg,溶于1 mL去离子水里,采用高效凝胶渗透色谱进行纯度鉴定和分子量测定[32]。检测条件[33]:GPC 色谱仪型号:LC-10A 型HPLC;检测器:示差检测器RID-10A;进样器:自动进样器 SIL-10AD;系统软件:SHIMADZU CLASS-VP;色谱柱:UltrahydrogelTMLinear 7.8 mm×300 mm实验条件:流动相:超纯水;流速:0.5 mL/min;柱温:40 ℃;柱操作压力:1.6 MPa;样品浓度:1 mg/mL;进样量:20 μL。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

葡萄糖标准曲线的绘制:采用硫酸-苯酚法测定葡萄糖在波长490 nm处的吸光度值,纵坐标为吸光度值(y),葡萄糖浓度值(x)为横坐标,得出葡萄糖标准曲线,结果如图1所示。标准曲线线性回归方程为y=0.129x-0.124,拟合系数R2=0.998,表明葡萄糖含量与吸光度值呈良好的线性关系(葡萄糖浓度0～0.05 mg/mL)。

图1 葡萄糖标准曲线图Fig.1 Glucose standard curve

牛血清蛋白标准曲线的绘制:采用考马斯亮蓝法测定葡萄糖在波长595 nm处的吸光度值,纵坐标为吸光度值(y),牛血清蛋白浓度值(x)为横坐标,得出牛血清蛋白标准曲线,结果如图2所示。标准曲线线性回归方程为y=0.122x-0.117,拟合系数R2=0.998,表明牛血清蛋白含量与吸光度值呈良好的线性关系(牛血清蛋白浓度0～100 mg/mL)。

图2 牛血清蛋白标准曲线Fig.2 The standard curve of bovine serum albumin

2.2 发芽糙米粗多糖脱蛋白工艺的研究

Sevage法和酶-Sevage法去除蛋白质的原理都是利用有机溶剂,使流离的蛋白变性成为不溶物,但粗多糖中含有糖蛋白,需要有机溶剂多次处理才能达到较好地去除蛋白的效果。由图3、图4可知,对发芽糙米粗多糖的脱蛋白处理次数越多,粗多糖的损失率越大,Sevage法经过4次处理后,尽管脱蛋白率已达到82.6%,但此时粗多糖已经损失过半,粗多糖得率较低,Sevage法反复处理次数较少时,脱蛋白效果不明显,因此本试验确定Seavge法对发芽糙米粗多糖溶液反复处理4次,此时粗多糖损失率为52%。酶-Sevage法经过2次处理后,蛋白脱除效果比较好,粗多糖损失也较少,采用此方法去除蛋白明显,因此本试验确定酶-Seavge法对发芽糙米粗多糖溶液处理2次。通过比较Seavge法(4次)、三氯乙酸法、酶-Sevage法(2次)三种脱蛋白方法,结果如图5所示,三种方法去除蛋白效果明显,粗多糖损失也明显。三氯乙酸法与Sevage法蛋白脱除率分别为84.17%和81.28%,尽管两种方法脱蛋白效率较好但粗多糖损失也较多,且Sevage法反复多次,操作麻烦且耗时,并耗费大量的有机试剂,不仅污染环境其成本也大。三氯乙酸法在酸性条件下与蛋白质作用同时,一定程度上通过酸水解作用也破坏了多糖的结构,不利于后续多糖结构分析和活性测定。酶Sevage法相对以上两种脱蛋白方法，在保证脱蛋白率较高的情况下，粗多糖损失率较少。综合评价脱蛋白效果与粗多糖损失,确定酶-Sevage法作为发芽糙米粗多糖的初步纯化方法。

图3 Sevage法脱蛋白Fig.3 Deproteinization with the Sevage method

图4 酶-Sevage法脱蛋白Fig.4 Deproteinization with the enzyme-Sevage method

图5 不同脱蛋白方法结果Fig.5 Results of different deproteining methods

2.3 发芽糙米多糖脱色工艺的研究

由图6可知,活性炭吸附脱色法的脱色率为88.44%,但会造成很多的粗多糖损失,这是因为活性炭在脱色的同时也会吸附大量的粗多糖,且存在脱色后溶液中的炭残渣难以完全去除的缺点。过氧化氢法脱色率较高,但由于过氧化氢是氧化性较强的氧化剂,过氧化氢氧化作用很有可能改变多糖的链状结构,从而影响粗多糖的活性。AB-8大孔树脂是弱极性树脂,对弱极性的有机化合物具有较强的吸附能力,对极性大的多糖类物质吸附力弱。发芽糙米粗多糖溶液经AB-8大孔树脂吸附色素后,脱色率为86.57%,粗多糖损失率为28.96%。三种脱色方法对粗多糖的脱色效果明显,粗多糖损失也明显。虽然脱色率比活性炭吸附法脱色率稍低,但粗多糖损失率相比大幅度降低,综合比较大孔树脂脱色效果较好。说明发芽糙米粗多糖中所含的色素物质极性与AB-8树脂的极性相近,故脱色效果较佳。

图6 不同脱色方法结果Fig.6 Results of different decoloring methods

由于大孔吸附树脂法脱色具有操作简便、条件温和、脱色效果佳、色素可回收等优点,综合考虑脱色效果与粗多糖损失两者的效应,AB-8大孔树脂吸附法是发芽糙米粗多糖最佳脱色方法。

2.4 柱层析填料的筛选

三种柱层析填料对发芽糙米粗多糖层析纯化过柱洗脱曲线如图7所示。

图7 (A)DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B洗脱曲线Fig.7 Stepwise elution curve of crude Polysaccharides on(A) DEAE-Cellulose 52,(B)DEAE Fast Flow,(C)DEAE Cl-6B chromatography column

由DEAE-Cellulose 52洗脱曲线可知,洗脱出三种多糖组分,第一个峰由蒸馏水洗脱得到,其含量为8.38%,经不同浓度的NaCl梯度洗脱,得到两个峰,含量分别14.11%和4.25%,洗脱后的多糖组分和含量都相对较少,峰2无明显的出峰时间间隔。且各个洗脱峰没很好的分离开来，所以DEAE-Cellulose 52凝胶柱对糙米粗多糖的分离效果不好。因此不能选用此填料对糙米粗多糖进行分离纯化。

由DEAE Fast Flow洗脱曲线可知,第一个峰型对称并且很明显,但其他的洗脱峰错综复杂,峰型不对称,并且峰与峰之间无明显的间隔,无法判断洗脱下来几种多糖组分,所以DEAE Fast Flow凝胶柱对发芽糙米粗多糖的分离效果不好。因此不能选用此填料对糙米粗多糖进行分离纯化。

通过比较发现DEAE-Sepharose CL-6B层析柱对发芽糙米粗多糖的分离纯化效果最好,多糖通过阴离子交换柱后因多糖所带电荷性质不同,分离得到五个洗脱峰,峰型狭窄对称,证明DEAE Sepharose CL-6B凝胶柱对发芽糙米粗多糖具有较好的分离效果。第一个峰由蒸馏水洗脱得到,其含量为32.82%,经不同浓度的NaCl梯度洗脱,得到四个峰,含量分别9.91%、8.15%、7.42%和1.92%,由于0.4 mol/L的NaCl洗脱下来的多糖含量较少,因此只收集含前三个主峰的试管中的洗脱液,对收集后的洗脱液减压浓缩后,上Sephadex G50层析柱进行脱盐,收集脱盐后的各组分多糖真空冷冻干燥。

2.5 发芽糙米多糖纯度鉴定及其分子量的测定

如图8所示,根据紫外光分析可知,在吸光度在220、260和280 nm处都没有明显的峰值,说明不含有蛋白和核酸这两种物质[19]。再采用高效凝胶渗透色谱检测其相对分子量,线性回归方程为:lg Mw=-0.1421tR+13.2451,式中:Mw为平均分子质量(kD);tR为保留时间(min);决定系数R2为0.9981。根据线性回归方程计算结果如下:水洗多糖组分的平均分子量为1.47×105g/mol,盐洗多糖组分的平均分子量为9.62×105、5.59×106和3.15×105Da。

图8 水洗多糖组分紫外光谱Fig.8 The UV spectra of fraction from Polysaccharides in distilled water

3 结论

经2次酶-Sevage法脱蛋白效果较好且粗多糖损失率低,脱蛋白率为74.36%,粗多糖损失率为14.09%。大孔树脂AB-8对发芽糙米粗多糖脱色效果最佳,脱色率为86.57%,粗多糖损失率为28.96%。对发芽糙米粗多糖进行柱层析的最佳填料为DEAE-Sepharose CL-6B。水洗多糖组分的平均分子量为1.47×105Da,盐洗多糖组分的平均分子量分别为9.62×105、5.59×106、3.15×105Da。