中药谱效学研究过程中差异样品的构建及应用∗

刘宏，苏薇薇，彭维，姚宏亮

(中山大学生命科学学院∥广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州510275)

中药谱效学研究是近年来中药研究的一个热点。谱效学能够准确反映中药的药效物质基础，它为中药质量控制、组方科学解析等提供了依据[1-6]。我们在进行中药谱效学研究过程中，需寻找中药化学成分差异与药效差异的对应关系，因此构建原料药材配比不同的系列差异样品很有必要；这在国内尚处于发轫阶段。我们提出一种中药谱效学研究过程中差异样品的构建方法，现报道如下。

1 差异样品构建的基本思路与方法

差异样品构建的基本思路：当中药有效成分群发生变化时，其药效也会随之发生改变。当某一成分的含量发生显著变化，而对应的生物活性并无显著改变，则表明该成分与药效关联性弱；反之，则表明该成分与药效关联性强。因此，在构建的差异样品中，各化学成分的变化十分重要。化学成分来源于药材，而复方中药又是由多味药材组成，通过对各味药材进行调整能够达到构建差异样品的目的。实际应用中，复方中药涉及到不同的药材以及各味药材的多个投料水平，是典型的多因素、多水平试验设计，均匀设计方法的使用则可大大降低试验次数并反映差异样品间的差异性。

基于上述思路，我们提出一种中药谱效学研究过程中差异样品的构建方法，具体如下：① 将各味组成药材单独视作试验因素；② 根据原组方比例确定各味药材的投料量变化范围；③ 在该范围内确定合适的水平数；④ 采用均匀设计方法，根据因素数、水平数选择合适的均匀设计表进行药材及其投料量的均匀排布；⑤ 按照标准工艺流程制备多组差异样品并进行其指纹图谱监测，采用聚类分析方法验证差异样品间的差异性。

2 差异样品构建的具体实施

我们以复方血栓通胶囊为例说明具体实施过程。复方血栓通胶囊由三七、丹参、黄芪、玄参组成，方中重用三七之活血化瘀为君药，丹参为臣药，破瘀血、补新生血，黄芪之补气升阳与玄参之滋阴凉血合用治疗气阴两虚为佐药。长期大量的医疗实践和临床应用证实，复方血栓通胶囊对眼底及心脑血管疾病疗效显著。复方血栓通胶囊差异样品的构建步骤如下：

2.1 材料

(1) 仪器、试剂：数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司，KQ-250DE)，涡旋振荡器(Scientific Industries Vortex-Genie 2)，旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，RE-5205/RE-2000B)，烘箱(Millipore，UFB400)，超纯水器(Millipore Simplicity)，电子分析天平(Sartorius)，冰箱(Siemens)，烧杯、锥形瓶、蒸馏瓶等玻璃仪器；甲醇、乙腈、磷酸(色谱纯)，超纯水。

(2) 药材：三七，批号：161110；丹参，批号：161110；黄芪，批号：161110；玄参，批号：161110，由广东众生药业股份有限公司提供。

2.2 方法

(1) 三七、丹参、黄芪、玄参投料设计

复方血栓通胶囊的原组方比例中三七、丹参、黄芪、玄参所占比例分别为54%、10%、18%、18%。在均匀设计时，丹参在0%-20%间均匀变化，黄芪在0%-36%间均匀变化，玄参在0%-36%间均匀变化，君药三七在33.2%-74.8%间均匀变化。根据四因素十一水平均匀设计表进行投料，见表1。

(2) 差异样品的制备

根据《中华人民共和国药典》2015年版复方血栓通胶囊标准工艺流程[7]，按表1进行药材投料：三七粉碎后用φ=50%乙醇浸渍提取2次，浸渍液滤过，滤液合并，回收乙醇并浓缩成浸膏；丹参、黄芪、玄参三味药材，用φ=50%乙醇加热回流提取2次，提取液滤过，滤液合并，回收乙醇并浓缩成浸膏；将上述两份浸膏混合，即得。

表1 复方血栓通胶囊差异样品的药材投料量及其比例Table 1 Herb proportions in Compound Xueshuantong Capsule (CXC) samples

(3) 差异样品的指纹图谱监测[8-9]

仪器与试剂：Dionex Ultimate 3000 DGLC高效液相色谱仪，Dionex Acclaim®120 C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，3 μm)，乙腈、磷酸(色谱纯)，超纯水。

供试品制备：取11组差异样品各约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加φ=70%甲醇20 mL，密塞，超声处理60 min，滤过，取滤液，减压回收溶剂至近干， 加φ=50%甲醇使溶解，定量转移至10 mL量瓶，加φ=50%甲醇至刻度，摇匀，用0.22 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

液相色谱条件：流动相A乙腈(0-50 min，15%→34%)，流动相Bw=0.05%磷酸溶液(50-59 min，34%→75%)，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长203 nm、270 nm。

2.3 结果

指纹图谱及其聚类分析结果：11组差异样品的色谱图见图1。根据20个共有峰峰面积，将其导入SPSS 21.0中对差异样品S1-S11进行聚类，聚类方法为Between-groups linkage，距离计算方法采用Minkowski。如图2所示，当Rescaled Distance Cluster Combine为4时，差异样品可分为8类，存在明显的化学成分含量差异。

图1 复方血栓通胶囊差异样品HPLC色谱图(A:203 nm；B:270 nm)Fig.1 HPLC chromatogram of CXC samples (A: 203 nm; B: 270 nm)

图2 复方血栓通胶囊差异样品聚类分析结果Fig.2 Cluster analysis of CXC samples

3 讨 论

由两味药材组成的复方中药品种，药材及成分组成相对简单，可直接通过对药材进行均匀配比的方法制备差异样品。当组方药材增加到三味及以上时，通过简单的药材均匀加减进行调配不再适用，一方面是由于很难满足各味药材的投料比的总和为100%，另一方面所构建的差异样品在全部药材组合下的空间分布不均匀，无法体现出差异性。在这种情况下，可考虑应用均匀设计思想指导各味药材的投料比例。

在差异样品的均匀设计中，因素数、水平数、投料变化范围的确定十分重要。当组方由三至六味药材组成时，因素数可直接由各味药材确定；水平数的确定，一方面考虑到为后续的差异样品化学信息与药效信息相关提供充足的样品保证，另一方面需考虑试验次数的增加带来的工作难度，一般考虑9-11水平，即构建9-11组差异样品为宜。

投料变化范围的确定，要考虑中药组方中的“君臣佐使”方解，在实际应用中，“君”药在整个组方中具有十分重要的地位，其投料范围在一定范围内调整但不能缺失，而“臣”、“佐”、“使”药可根据需要设置缺失；上述三个参数的设定原则在应用实例复方血栓通胶囊的差异样品构建中均有体现。

当组方由六味及以上的药材组成时，若因素数直接由药材数量确定，均匀设计试验的水平数至少要在12水平以上，保证较好的均匀度则需更进一步增加水平数，大大增加了工作量与难度。因此，建议根据药材的化学性质或传统方解中的君臣佐使，先把所有药材分为三至六类，再进一步构建所需差异样品。

应用实例中，我们介绍了复方血栓通胶囊具有化学成分差异的样品构建过程，这些差异样品在药效上是具有明显差异的[2]。

近年来，我们还完成了脑栓通胶囊[10]、参芪扶正注射液[11]、丹红注射液[12]、口炎清颗粒[13]等中药品种差异样品的构建及其药效、机理、谱效关联研究。上述实践与应用经验表明：本文提出的方法不同于以往的化学成分逐一分离、再组合的方式，而是在尊重原组方药材比例的基础上从整体对复方中药的药材进行重新调整、组合，具有实现难度小、适用性高的优点，符合中药的混合性、整体性、统一性特点。