甲状腺乳头状癌中FMNL2和EMT相关蛋白的表达及其临床意义

曹学全 章辉 卢洪胜 戴岳楚 魏科娜 杨朝晖 范广民 顾华敏

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，在过去几十年中其发病率已经增加了3倍，超过四分之三是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1-2]。PTC的发病机制尚不完全清楚，研究与PTC发生、发展有关的基因具有重要意义。上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是恶性肿瘤发生浸润转移的细胞学基础，在EMT过程中，肿瘤细胞表现为上皮标志物如E-钙粘素等表达下降，细胞黏附减弱，间质标志物如波形蛋白等表达增加[3]。同源形成素样蛋白2（forminlike protein 2，FMNL2）是近年来发现与转移相关的一种新基因，属于形成素同源蛋白家族成员之一。FMNL2可作为Rho家族鸟苷三磷酸酶的效应分子，并在致癌中发挥重要作用。FMNL2在肺癌、恶性黑色素瘤等多种恶性肿瘤中表达增加，并且与侵袭、转移呈正相关[4-6]。关于PTC组织中FMNL2表达的临床意义及与EMT相关蛋白关系的研究鲜见文献报道，本研究采用免疫组化En Vision法检测FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白在PTC和相应癌旁组织中的表达差异，分析FMNL2和EMT相关蛋白的关系及对PTC发生、发展的可能作用机制，为PTC的分子靶向治疗提供新思路。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年1月至2018年1月我院住院行手术切除PTC标本80例，术后均经病理检查证实为PTC。所有患者术前均未接受放疗、化疗及生物学治疗。80例PTC患者中，男26例，女54例；年龄21～77（45.37±12.04）岁，其中＜45岁42例，≥45岁38例。肿瘤直径≤2cm 56例，＞2cm 24例；伴有包膜侵犯28例，无包膜侵犯52例；伴有淋巴结转移47例，无淋巴结转移33例；参照2010年第7版美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联合会（UICC）制定的甲状腺癌分期标准进行TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期27例。同时选取其中30例患者距离肿瘤2cm的相应癌旁组织（经病理检查为正常甲状腺组织）作为对照组。

1.2 主要试剂 FMNL2兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司，E-钙粘素和波形蛋白鼠抗人单克隆抗体购自福州迈新生物技术有限公司，EnVision通用试剂盒及二氨基联苯胺（DAB）均购自广州基因公司。

1.3 免疫组化方法 应用免疫组化En Vision法检测FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白的表达。严格按照试剂盒说明书操作，石蜡切片常规脱蜡至水。3%H2O2室温孵育10min，0.1mmol/L枸橼酸盐缓冲液微波修复，3%BSA封闭30min，分别滴加一抗（FMNL2抗体浓度为1∶200，E-钙粘素和波形蛋白均为1∶100）4℃过夜，滴加二抗（En Vision免疫组化检测试剂），DAB显色，苏木素复染，盐酸分化、乙醇及二甲苯脱水和树胶封固，显微镜下观察。以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。

1.4 结果判定 以细胞质或细胞膜出现淡黄色或棕黄色颗粒为阳性，FMNL2和波形蛋白均定位于细胞质，E-钙粘素定位于细胞质或细胞膜。在光学显微镜下，每张切片随机选取至少5个高倍视野（×400），观察并记录每张切片的染色强度和面积，通过半定量积分法进行判定。染色强度：无显色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞数的百分比：阳性细胞数百分比≤5%为 0分；6%～10%为1分；11%～20%为 2分；21%～50%为 3分；＞50%为4分。细胞染色强度与阳性细胞百分比计分的乘积为每例的最终积分。＜3分为阴性，≥3分为阳性。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料组间比较采用χ2检验，PTC中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白之间表达的相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC和癌旁组织中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白的表达 FMNL2、波形蛋白在PTC组织中阳性表达率分别为 61.25%（49/80）和 76.25%（61/80），癌旁组织分别为 13.33%（4/30）和 20.00%（6/30），差异均有统计学意义（χ2=20.064、28.994，均P＜0.05）；而 E-钙粘素在PTC组织中的阳性表达率为32.50%（26/80），显著低于癌旁组织的80.00%（24/30），差异有统计学意义（χ2=19.855，P＜0.05）。见图 1（见插页）。

2.2 PTC组织中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白表达与临床病理特征的关系 FMNL2、波形蛋白表达在包膜有无侵犯、淋巴结是否转移及不同临床分期者间的差异均有统计学意义（均P＜0.05），而在不同年龄、性别和肿瘤直径者中的差异均无统计学意义（均P＞0.05）；E-钙粘素在包膜侵犯、淋巴结转移及Ⅲ～Ⅳ期PTC者中阳性表达率低，在无包膜侵犯、无淋巴结转移及Ⅰ～Ⅱ期PTC者中阳性表达率高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），而在不同年龄、性别和肿瘤直径者中的表达差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 PTC组织中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白的表达与临床病理特征的关系

2.3 PTC原发灶和淋巴结转移灶中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白的表达情况 47例原发灶组织中FMNL2阳性表达率为76.60%（36/47），对应淋巴结转移灶组织中的阳性表达率为100.00%（47/47），淋巴结转移灶中FMNL2 表达明显高于原发灶（χ2=9.553，P＜0.05）；淋巴结转移灶组织中波形蛋白阳性表达率为100.00%（47/47），高于原发灶的91.49%（43/47），差异有统计学意义（χ2=4.178，P＜0.05）；淋巴结转移灶组织中E-钙粘素阳性表达率为4.25%（2/47），低于原发灶的17.02%（8/47），差异有统计学意义（χ2=4.028，P＜0.05）。

2.4 PTC组织中FMNL2、E-钙粘素和波形蛋白表达的相关性 PTC组织中FMNL2、波形蛋白表达与E-钙粘素表达均呈负相关（r=-0.325、-0.554，均P＜0.05），FMNL2表达与波形蛋白表达呈正相关（r=0.340，P＜0.05）。见表 2、3。

3 讨论

据报道，EMT和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是造成肿瘤细胞侵袭和转移的原因[7]。EMT在胚胎发育过程中是一种从上皮细胞向间充质细胞表型转化的重要表型，与肿瘤的侵袭和转移密切相关[8]。EMT的特征是上调间充质细胞特异性标记蛋白，包括N-钙黏着蛋白和波形蛋白，以及下调上皮细胞特异性标记蛋白，如E-钙粘素，MMPs和细胞外基质蛋白分泌增多，基底膜和细胞外基质被破坏，从而细胞获得运动迁移能力[9]。本研究结果显示，PTC组织中波形蛋白阳性表达显著高于癌旁正常组织（P＜0.05），而E-钙粘素在PTC组织中表达下调，明显低于癌旁正常组织（P＜0.05），提示EMT相关蛋白（波形蛋白和E-钙粘素）异常表达可能在PTC发生过程中起作用。进一步研究发现，波形蛋白在PTC包膜侵犯、淋巴结转移、Ⅲ～Ⅳ期及淋巴结转移灶组织中阳性表达率高，而在PTC无包膜侵犯、无淋巴结转移、Ⅰ～Ⅱ期及原发灶组织中阳性表达率低，差异有统计学意义，而E-钙粘素表达情况则相反，表明EMT相关蛋白表达状态改变可能参与PTC的局部浸润、淋巴结转移及临床进展的过程。

表2 PTC组织中FMNL2、波形蛋白表达与E-钙粘素表达的相关性

表3 PTC组织中FMNL2、波形蛋白表达的相关性

FMNL2编码蛋白质是进化上保守formin家族的蛋白质成员，这些蛋白质是细胞骨架的调节剂。FMNL2具有影响肌动蛋白聚合和肌动蛋白丝形成的结构域，是建立在迁移和侵袭过程中调节细胞边缘突起的肌动蛋白聚集因子[10-11]。在生理和病理情况下，FMNL2在细胞生长过程中发挥关键作用，如丝状体形成、细胞迁移、胞质分裂、细胞黏附、细胞极性和肿瘤进展等[12]。有文献报道，FMNL2具有Rho家族鸟苷三磷酸酶结构域，细胞运动时可形成伪足，在结直肠癌细胞侵袭转移过程中起重要作用[13]。荧光定量聚合酶链反应结果证实，FMNL2 mRNA水平在舌鳞状细胞癌中显著升高，且其高表达与淋巴结转移和晚期肿瘤密切相关，表明FMNL2作为转移的正调控因子。多因素分析显示FMNL2表达具有独立的预后意义[14]。本研究采用免疫组化En Vision法检测PTC和相应癌旁正常组织中FMNL2的表达情况，结果显示，PTC组织中FMNL2蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织（P＜0.05），并且PTC随着包膜侵犯、淋巴结发生转移及临床分期增加，FMNL2蛋白阳性表达率进一步升高（P＜0.05），表明FMNL2表达升高可能与PTC的发生、侵袭和转移有关，本研究结果与上述文献报道一致。为了进一步显示FMNL2在PTC转移中的作用，本研究检测了原发灶和对应淋巴结转移灶中FMNL2的表达差异，发现淋巴结转移灶组织中FMNL2表达明显高于原发灶（P＜0.05），提示FMNL2表达升高可能会导致原发灶的一些癌细胞容易发生转移。

Li等[15]发现，FMNL2通过Smad3效应分子或者MAPK/MEK信号通路参与TGF-β诱导的EMT，进而促进结直肠癌细胞侵袭和转移。本研究还分析FMNL2与EMT相关蛋白的相关性，发现FMNL2、波形蛋白表达与E-钙粘素表达均呈负相关，FMNL2表达与波形蛋白表达呈正相关，提示在PTC组织中，FMNL2表达与EMT相关蛋白表达密切相关，FMNL2过表达可能与EMT的发生有关。综合上述研究结果，FMNL2和EMT相关蛋白异常表达可能联合参与PTC的发生、恶性进展过程，为PTC的靶向治疗和预后判断提供新思路。