芒柄花素对肺动脉高压大鼠的治疗作用及机制研究

吕望 王胜男 金焕治 林岳 陈新国

近年来对肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension，PAH）的认识发生明显转变。PAH曾经被认为是由血管收缩张力增加引起的，然而血管扩张剂没有达到令人满意的临床结果。现在认为PAH的特征性血管异常

主要表现为远端肺小动脉的内膜增厚，进而导致PAH的发生，最终右心衰竭是患者主要的死亡原因[1]。炎症在驱动血管平滑肌细胞的过度增殖以及随后血管结构变化中发挥了重要的作用。含核苷酸结构域的Nod样受体家族3（NLRP3）炎性小体是一种存在于细胞内的多蛋白复合物，可被多种病原体或危险信号所激活，通过活化半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-1、IL-1、IL-18等促炎细胞因子的成熟和分泌，调节免疫和炎症反应。芒柄花素是黄芪根中的O-甲基化异黄酮植物雌激素，具有多种生物学效应，包括抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗癌等作用[2-4]。近年来研究提示在多种心血管疾病中也具有重要作用[5-6]，但在PAH中的作用及机制尚不明确。因此本实验通过皮下注射野百合碱（monocrotaline，MCT）建立大鼠PAH模型，观察芒柄花素对血管壁增厚的影响及可能的分子机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 MCT（美国Sigma-Aldrich）；芒柄花素 HE染色试剂盒（武汉博士德公司）；抗α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 抗体（美国 Sigma-Aldrich）；抗NLRP3抗体、鼠兔二抗（美国Cell Signaling Technology公司）；抗β-actin抗体（武汉博士德公司）；TNF-α、IL-1和IL-6的ELISA试剂盒（英国Abcam公司）；RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂（中国碧云天公司）。

1.2 动物分组与模型制备 32只SD雄性大鼠（体重180～220g）购自浙江省医学实验动物中心。动物实验开始前适应性喂养 2～3d，自由饮食饮水，每笼饲养 4只。将32只大鼠随机分为对照组、MCT组、芒柄花素低剂量组（25mg/kg）和芒柄花素高剂量组（50mg/kg），每组8只。除对照组外，其余各组大鼠一次性皮下注射60mg/kg MCT（将0.2g MCT溶解于1mol/L盐酸中，先加入1mol/L氢氧化钠调整pH至7.35～7.45，再加入0.9%氯化钠注射液定容至10ml）；对照组大鼠注射相同剂量的0.9%氯化钠注射液；芒柄花素低剂量和高剂量组大鼠于MCT注射2周后予芒柄花素（用橄榄油溶解，0.2mg/ml）灌胃，剂量分别为25mg/kg和50mg/kg，1次/d，连续14 d。对照组及MCT组大鼠予等量橄榄油灌胃。

1.3 血流动力学和心室重量测定 造模4周后，将大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠60mg/kg麻醉，切开右侧颈部组织，分离出右颈外静脉，将3.5号脐静脉导管从右颈外静脉插入右心室，可见振幅明显的右心室波，记录并分析右心室收缩压（right ventricular systolic pressure，RVSP），处死大鼠后取出心肺，分离心脏，剪去心房，沿室间隔边缘剪出右心室，留下室间隔和左心室，沿室间隔边缘修剪，均由同一人员操作。称量右心室重量（RVW）、左心室及室间隔的重量（LV+s），计算右心肥厚指数（RVHI）=RV/（LV+s）。

1.4 肺小动脉结构观察 切取肺组织，石蜡包埋后切片3μm，按常规方法脱蜡至水，然后将切片行HE染色，选取外径50～200μm的肌性小动脉，观察动脉管壁厚度。

1.5 α-SMA和NLRP3表达的检测 采用Westem blot法。提取肺动脉总蛋白，蛋白变性，使用12%SDS-PAGE分离蛋白；采用半干转方法将蛋白转印至NC膜上，使用5%脱脂牛奶室温封闭NC膜1h；封闭完成后，漂洗NC膜，并在其上加入α-SMA和NLRP3的一抗于4℃过夜；次日清晨漂洗NC膜，加入鼠二抗室温1h；二抗孵育结束后显色，定影后通过凝胶图像仪处理，将胶片进行扫描，再系统分析目标带的分子量和净光密度值。根据条光带密度值除以β-actin作归一化处理，得到α-SMA和NLRP3蛋白的表达水平。

1.6 NLRP3 mRNA表达水平的检测 采用Trizol法提取肺动脉总RNA，将RNA反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR检测mRNA水平。引物序列如下：NLRP3：5′-ACAGACAAGATTTGAAAGAAGCGGTGA，3′-TCCGAAGTTGGTGG G CCAGA，β-actin：5-CTGCCTGACGGCCAAGTC，3′-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA。以β-actin作归一化处理后，得到NLRP3 mRNA的表达水平。

1.7 炎症因子检测 大鼠麻醉后，用5ml注射器在腹主动脉抽取动脉血，3 000r/min离心10min，并储存于-80℃保存。采用ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1和IL-6水平。具体操作按照试剂盒的说明。

1.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnet-t法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.14 组大鼠RVSP、RVW、RVHI的比较 与对照组相比，MCT 组RVSP、RVW、RVHI均显著增加（均P＜0.05）；与MCT组比，芒柄花素低剂量组和芒柄花素高剂量组RVSP、RVW、RVHI均显著降低（均P＜0.05），见表 1。

2.2 4组大鼠肺血管壁增厚以及α-MSA表达的比较HE染色结果表明，与对照组比较，MCT组的肺动脉管壁明显增厚，管腔明显狭窄，而芒柄花素低剂量组和芒柄花素高剂量组可明显改善这一病理变化，详见图1（见插页）。与对照组相比，MCT组α-SMA的表达明显上调（P＜0.05），而芒柄花素低剂量组和芒柄花素高剂量组α-SMA显著降低（P＜0.05），详见图2和表2。

表14组大鼠RVSP、RVW、RVHI的比较

图2 4组大鼠肺组织α-SMA蛋白表达电泳图

表2 4组大鼠α-SMA蛋白表达水平的比较

2.3 4组大鼠血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平的比较 与对照组相比，MCT 组血清 TNF-α、IL-1、IL-6、水平均明显增加（均P＜0.05），而芒柄花素低剂量组和芒柄花素高剂量组TNF-α、IL-1、IL-6、水平均显著降低（均P＜0.05），见表 3。

表3 4组大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-6水平的比较（pg/ml）

2.4 4组大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表达水平的比较与对照组相比，MCT组NLRP3 mRNA和蛋白表达水平均明显上调（均P＜0.05），而芒柄花素低剂量组和芒柄花素高剂量组NLRP3 mRNA水平以及蛋白表达水平均显著降低（均P＜0.05），见表4。

表4 4组大鼠NLRP3 mRNA以及蛋白表达水平的比较

3 讨论

PAH患者由于肺小血管阻力和压力的逐渐增加损害右心室功能，导致右心衰竭，并最终导致患者死亡[7]。本研究中对于MCT诱导的PAH大鼠模型，芒柄花素治疗使得反映肺动脉压的RVSP明显下降。右心室对压力负荷增加的反应被认为是提示预后的关键[8]。相比于对照组，MCT处理的大鼠肺小动脉管腔狭窄以及右心室肥厚，芒柄花素减轻MCT诱导的肺小动脉重构和随后出现的右心肥厚。金雀异黄素、白藜芦醇已被证明可预防MCT诱导的大鼠PAH[9-10]，虽然这些研究已经证明了天然抗氧化剂在PAH中的潜在益处，但其潜在机制尚未完全确定。本研究结果提示芒柄花素作为PAH的另一种潜在治疗方法，并发现了PAH中抗炎剂的共同作用机制。

炎症在人类PAH以及实验模型中都起着关键作用[11-12]。对于外界损伤和应激的反应，肺血管细胞产生炎症介质，从而招募炎症细胞。炎性细胞可能延长细胞因子和生长因子的释放，形成正反馈回路。在PAH中这些过程可导致血管重塑、基质重塑、胶原沉积、血管细胞增殖和迁移，最后肺阻力增加和右心衰竭。除了增加血管周围和血管内的积累外，某些细胞因子和趋化因子的循环水平异常升高。其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白-1、FractAlgin、CcL5/RANTES 和 TNF-α[13]。这些细胞因子和趋化因子中的一些与PAH患者的不良临床结果密切相关，并且可以作为疾病进展的生物标志物。在PAH的患者中观察到IL-1β和TNF-α与细胞外基质蛋白的积累有关，而其他的如IL-6与平滑肌细胞的增殖有关[14]。TNF-α相关凋亡诱导配体在许多PAH实验模型中已被证实在内皮细胞凋亡和平滑肌细胞增殖中起关键作用，其抑制与疾病病理的预防呈正相关。在骨形态发生蛋白和5-羟色胺和IL-1信号调节下，骨保护素在PAH患者的平滑肌细胞和血清中高表达，并能刺激其迁移和增殖[15]。本研究同样发现MCT诱导的PAH使得血清TNF-α、IL-1和IL-6增加，而芒柄花素能抑制它们的增加，说明芒柄花素能通过抑制炎症反应，从而抑制肺小动脉的重构。最终芒柄花素作为一种抗炎剂可以抑制肺动脉压力的升高，防治右心衰竭。

NLRP3在多种类型的肺损伤中被激活。肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体可增加肺泡伸展性，诱导IL-1的释放。在急性肺损伤模型中NLRP3缺陷小鼠表现出炎症反应的抑制和肺上皮细胞凋亡的减少。同样的抑制NLRP3的表达可以降低TNF-α、IL-6以及减缓急性肺损伤[16]。多个抗炎剂在MCT诱导的PAH都展现了良好的作用，进一步提示诸如TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH中也发挥了关键的作用[17-18]。本研究表明MCT可以诱导TNF-α、IL-1以及IL-6的升高和NLRP3炎性小体的激活。考虑到TNF-α、IL-1以及IL-6在PAH发病机制中的作用，以及炎性体和炎症因子的相互作用，我们认为抗炎剂对PAH的作用可能就是通过抑制NLRP3炎性小体来实现。

总之，芒柄花素通过抑制NLRP3信号通路减轻炎症反应，从而减少肺小动脉的重构，最终治疗PAH。炎症是PAH发生、发展的重要过程。因此，本研究发现NLRP3炎症通路在PAH中可能的重要作用，为PAH的防治提供了新的治疗思路。