外周血单核细胞COX-2表达与MPA形成和冠心病的关系研究

黄青华 沃铭毅 陈敏强 袁武锋 赵嫣 费鲜明

动脉粥样硬化（AS）是冠心病等心脑血管疾病的主要病理基础[1]。慢性炎症反应对AS的发展起着重要促进作用，其中单核细胞与血小板聚集体（MPA）形成所诱导的炎症反应在AS的发生和发展中扮演重要的角色[2-3]。MPA可通过NF-κB信号通路诱导单核细胞活化而引起环氧化酶-2（COX-2）表达增高[4]；笔者既往研究表明，木瓜蛋白酶可通过抑制中心因子AKT磷酸化而降低MPA诱导的单核细胞COX-2表达，并抑制单核细胞粘附和分泌功能，提示单核细胞COX-2可能在AS及冠心病的发生、发展中扮演重要角色[5]。因此，单核细胞COX-2表达增高可能有助于预测AS及冠心病的发生，并可作为其风险标志物。笔者通过观察冠心病患者外周血单核细胞COX-2表达，探讨其与MPA形成和冠心病发生之间的关系，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2017年10月1日至12月31日在我院住院的冠心病患者66例，男41例，女25例，年龄34～78（46.0±25.0）岁；其中稳定型心绞痛（SA）37 例，男24 例，女 13 例，年龄 34～72（47.6±18.3）岁；不稳定型心绞痛（UA）29例，男 19例，女 10例，年龄 37～78（49.2±17.1）岁。纳入标准：（1）AS 性心脏病患者；（2）符合冠心病诊断标准；（3）首次入院确诊者；（4）入院后治疗前。排除标准：（1）急性心肌梗死；（2）急慢性感染或炎症；（3）高血压；（4）肝肾功能异常；（5）恶性肿瘤；（6）脑血管疾病；（7）动静脉血栓史；（8）手术后；（9）孕妇；（10）2 周内服用过任何药物；（11）1个月内使用过抗血栓药物。收集同期在我院健康体检者30例作为正常对照组，男20例，女 10 例，年龄 35～72（45±23）岁；均无常规血液学检验、超声、X线等检查异常者。本研究均经患者或其家属以及体检人员知情同意。各组间性别、年龄的比较均无统计学差异（均P＜0.05）。

1.2 主要试剂与仪器、材料 CD41-FITC及CD14-PE单克隆抗体（法国Immunotech公司），COX-2单克隆抗体（美国Cell Signaling生物技术公司），细胞裂解液和TEN缓冲液（自配），MCP-1 ELISA试剂盒（美国Bioscience公司），淋巴细胞分离液（北京鼎国昌盛生物技术公司），RPMI1640培养液（上海佳和生物科技有限公司）。FBS（美国Hyclone公司）。FC500-MCL流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）、Mindray BC-6800血细胞分析仪和CRP-M100分析仪（中国迈瑞医疗公司），酶标仪（美国BIO-RAD公司）、改良Neubauer计数板。

1.3 MPA水平和炎症指标测定 清晨空腹采集冠心病患者和志愿者静脉血。采集枸橼酸三钠1∶9抗凝血2.7ml，加入CD14和CD41单克隆抗体，以流式细胞仪检测同时表达CD41和CD14的血小板比例，即MPA水平（%）；采集EDTA-K2抗凝血2ml，以血细胞分析仪测定WBC、中性粒细胞、淋巴细胞，并计算中性粒细胞-淋巴细胞比值（NLR），以CRP-M100分析仪测定超敏C反应蛋白（hs-CRP）浓度；采集无抗凝血 3ml，1 500g离心分离血清，采用单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA试剂盒测定MCP-1水平。操作均严格按照仪器和试剂盒说明书进行。

1.4 外周血单核细胞分离、处理和COX-2水平检测按照笔者以往研究中的单核细胞分离、处理和Western blot检测方法[5]。具体为：取健康人员和冠心病患者静脉血3～5ml，肝素抗凝，Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMC），用含10%FBS的RPMl1640培养液悬浮，置6孔板中培养，37℃、5%CO2孵箱贴壁2h后，用预温培养基洗去未黏附细胞，悬浮细胞可重复黏附，得到更多贴壁，以培养基重新悬浮贴壁细胞，以流式细胞仪检测表达CD14的细胞比例，表达率＞90%为符合要求。然后以Neubauer计数板计数并调整细胞数为5×105个/ml。以β-actin为内参，前述单核细胞悬液以细胞裂解液裂解细胞，充分混匀后取等量标本上样以SDS-PAGE电泳；转膜2h；脱脂奶粉封闭后COX-2单克隆抗体，孵育过夜；TBST漂洗膜；用HRP标记的抗体孵育；ECL发光底物显色后在Bio-Rad成像系统曝光。曝光结果用Image J软件进行光密度检测。

1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。计量资料以表示，组间比较采用成组t检验，相关性分析采用Pearson相关，危险因素分析采用logistic回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组炎症指标、MPA和COX-2水平的比较 冠心病组 hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平均高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；UA组hs-CRP、MCP-1、WBC和NLR水平以及MPA和COX-2水平均高于SA组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。见表1、图1。

2.2 冠心病患者COX-2水平与MPA及各炎症指标水平的相关性 相关性分析显示，COX-2表达水平与MPA、MCP-1、NLR 和 hs-CRP 均呈正相关（r=0.703、0.631、0.603、0.532，均P＜0.01）。COX-2 水平升高的冠心病患者MPA水平显著高于COX-2水平正常的患者，MPA水平升高冠心病患者COX-2水平显著高于MPA水平正常的患者（P＜0.01）；见图2。

表1 各组炎症指标的比较

图1 SA和UA组患者MPA和COX-2水平比较（与对照组比较，*P＜0.01；与 SA 组比较，**P＜0.01）

2.3 冠心病患者logistic回归分析结果 单因素回归分析显示COX-2、MPA、年龄、各炎症指标均为冠心病的危险因素，多因素回归分析显示，除年龄、性别和WBC之外，其余各指标均为冠心病的独立危险因素，COX-2比其余指标具有更高的OR值；见表2。

3 讨论

图2 冠心病危险因素单核细胞COX-2水平与MPA水平的关系（与COX-2正常组、MPA正常组比较，**P＜0.01）

表2 冠心病危险因素logistic回归分析结果

AS是一种慢性炎症性病变过程，血小板和WBC参与的炎症反应在动脉硬化性血栓形成性疾病如冠心病的发生和发展中扮演重要角色[6]。众多研究表明，炎症在AS相关的心血管疾病发生、发展过程中起着重要的作用[7]；并且单核细胞诱导的慢性炎症反应及巨噬细胞形成在AS的早起过程中起着重要的作用[8]。慢性炎症多以WBC增高和各种炎症介质分泌为基本现象，从而可以各炎症指标的水平作为其评价基础。单核细胞活化是一个复杂的过程，体现为趋化、黏附功能增强，并以炎症因子如MCP-1分泌等为基本表征[9]。在本研究中，冠心病患者炎症指标 MCP-1、hs-CRP、WBC和NLR水平明显高于正常人群，显示各炎症指标变化趋势具有一致性，符合炎症反应的基本表现。以上结果一方面表明炎症反应与冠心病发生关系密切，同时也表明炎症反应增强可使患者AS风险增加，从而导致冠心病的发生。另外，UA患者比SA患者具有更高水平炎症指标表达，表明多种因素所诱导的炎症反应可能与AS的进展以及冠心病病情严重程度有关。因此，测定炎症指标水平可能有助于预测冠心病风险以及评估患者病情。

单核细胞与血小板黏附形成MPA并诱导两者相互激活在AS发生中起着尤为重要的作用[8]。MPA及血小板源性细胞介质协同诱导单核细胞信号转导通路活化、促使其分泌和表达多种活性因子、显著增强其趋化及黏附能力并介导炎症细胞黏附，从而放大或延长炎症反应，是AS发生、发展的上游病理生理基础[10]。这充分表明MPA及其诱导的单核细胞活化在AS性疾病的发生、发展的早期过程中具有极为重要的作用。MPA形成可显著增强单核细胞功能，有利于活化单核细胞侵入损伤内皮细胞参与炎症反应，并转化为巨噬细胞吞噬氧化型低密度脂蛋白（Ox-LDL），从而形成泡沫细胞，这是AS发生的关键[11]。因此，MPA形成和炎症反应与心血管疾病关系密切。MPA形成过程中PS/PSGL-1连接可激活MAPK，通过MAPK ERK/p38而使单核细胞COX-2表达升高，调控单核细胞活化和黏附[4]。其中，COX-2可调节前列环素的产生从而对慢性炎症的发生具有重要促进作用[4]。在笔者的前期研究中显示，木瓜蛋白酶抑制COX-2蛋白表达的同时，能降低单核细胞的黏附及其分泌炎症蛋白MCP-1[5]，表明抑制COX-2可有效抑制炎症反应；因此，COX-2可能作为炎症调控的靶点，其表达增加可能是MPA形成并激活单核细胞参与炎症反应从而导致AS发生的关键物质，而若能有效抑制其表达可能有助于AS相关疾病的防治。尽管笔者在本研究中只检测和观察了单核细胞COX-2蛋白表达的改变，并未同时采用PCR法测定COX-2 mRNA表达，但研究结果显示，SA和UA患者均表现为MPA形成和单核细胞COX-2表达增加，并且UA患者比SA患者MPA和COX-2具有更高水平，表明COX-2表达增加与MPA形成增多具有一致性。而进一步研究显示，冠心病患者单核细胞COX-2表达水平与MPA比例呈正相关，并与炎症指标水平具有正相关，进一步揭示和证实以COX-2表达为代表的炎症标志物水平增加与MPA形成诱导单核细胞活化引起的炎症反应程度增高具有明显相关性。结果同时也揭示了COX-2表达水平高低与冠心病进展与否有密切的关系。因此，COX-2作为重要的炎症调控分子，其在MPA诱导的单核细胞活化后的炎症调控中扮演着重要角色，可能有助于冠心病的预测和病情评估。

炎症标志物水平在冠心病预测及其风险评估中具有重要价值[6]。报道显示，hs-CRP、WBC和NLR对冠心病预测有较高价值，并与病情严重程度有关；并且hs-CRP和NLR可作为急性冠脉综合征的独立危险因素[12-14]。因此，炎症标志物在冠心病诊断与预后中具有重要的意义。本研究在预测冠心病的各种炎症指标中，炎症调控因子COX-2具有最高的OR值，单因素和多因素分析分别为7.812和6.332，表明患者单核细胞COX-2表达水平升高可显著增加冠心病的风险，并作为其独立危险因素有助于预测冠心病发生的风险；同时结果也进一步提示并证实如有效抑制其表达可能有助于降低冠心病风险。

综上所述，本研究通过对冠心病患者外周血单核细胞COX-2表达水平进行评估，初步提示COX-2表达增高与MPA形成增多具有联动关系，并可作为冠心病风险的独立预测因子。在此基础上，如能进一步结合COX-2 mRNA检测进行研究，将更有利于临床实际应用。