配对盒4基因单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病相关性研究

金 燕 詹 欣

作者单位：1杭州市富阳区第二人民医院妇产科（杭州 311404）；2杭州市第一人民医院妇产科（杭州 310006）

妊娠期糖尿病（GDM）是妊娠期出现的葡萄糖耐受不良，与先兆子痫、胎儿围产期死亡和2型糖尿病（T2DM）发生风险增加有关[1-2]。妊娠期外周胰岛素抵抗增加的原因包括雌激素、人胎盘泌乳素和催乳素的产生增加[3]。研究显示，肥胖、家族史、生活方式、种族特点、遗传因素等均是GDM和T2DM的危险因素[4-6]。近年来遗传因素与GDM的相关性逐渐成为研究的热点，配对盒4（PAX4）基因在维持胰岛素细胞表型和胰岛β细胞的增殖和分化具有非常重要的作用[7]。本研究选择PAX4基因的rs10229583位点和rs114202595位点的基因多态性进行分析，旨在探讨PAX4基因的这两个单核苷酸多态性（SNPs）对于GDM的发病风险的影响，为GDM的预防和治疗提供依据，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2014年3月—2016年10月杭州市富阳区第二人民医院收治的临床资料完整的205例GDM患者作为研究组。纳入标准：（1）年龄＞20岁；（2）诊断标准符合国际妊娠糖尿病研究协会关于 GDM 的诊断标准[8]；（3）汉族。排除标准：（1）妊娠前即患有糖尿病的患者；（2）慢性高血压患者；（3）肾功能不全患者；（4）类风湿性关节炎患者；（5）系统性红斑狼疮患者。同期招募125名健康妊娠的妇女作为对照组。所有研究对象均签署知情同意书，经本院医学伦理委员会审核通过。

1.2 方 法 记录所有研究对象年龄、孕周、体质量指数（BMI）、血糖水平（口服葡萄糖耐量试验 0、1、2h）、血清糖化血红蛋白（HbA1c）水平、甘油三酯浓度。所有研究对象在妊娠24～28周之间接受75g口服葡萄糖耐量试验，均于禁食12h后在上午8:30-9:30之间进行检查，采用日立生化分析仪7600型检测血糖水平；采用乳胶增强免疫比浊法测定血清HbA1c水平；化学发光法检测甘油三酯水平，检测仪器为Olympus400全自动生化仪（日本）。BMI计算方法为体质量（kg）与身高平方（m2）的比值。

1.3 基因型检测 从研究对象外周静脉血中抽提基因组DNA（试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit（50），批号 51104，QIAGEN，德国）。抽提基因组 DNA后采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的片段进行Sanger测序，rs10229583位点的PCR扩增引物序列为：5’-CAACAGTGCTGCCTATTCCC-3’（正向）；5’-TAGGAAAGGAGATGCCCTCA-3’（反向）。rs114202 595位点的PCR扩增引物序列为：5’-GTAGGTGGAGACAGATGGGAAA-3’（正向）；5’-GTAGTCCCTGGTCCTCCTGTAA-3’（反向）。PCR反应体系（终浓度） 为：10ng gDNA，1×PCR buffer，200mmol的正反向引物，2.0mmol/L MgCl2，无核酸酶水补足 20μL。PCR 反应条件为：95℃预变性 10min；95℃，20s；60℃，20s；72℃，20s；共 35 个循环；然后 72℃，10min；4℃，∞。PCR完成后将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳切胶纯化 [试剂盒为QIAquick Gel Extraction Kit（50），批号 28704，QIAGEN，德国]后采用 Sanger测序检测产物的序列，测序仪为ABI310型基因分析仪（美国），见图1。

1.4 统计学方法 应用SPSS21.0软件进行统计分析。连续变量用均值±标准差（s）表示，并用t检验。使用 Pearson's χ2检验和比值比（OR）分析 SNPs位点基因型和等位基因与GDM的相关性。使用χ2检验评估基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡。所有检测均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 PAX4基因rs10229583和rs114202595位点SNPs基因型Sanger测序结果

2 结果

2.1 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女一般资料比较 研究组年龄 24～35岁，平均（30.54±4.35）岁，孕周（38.15±2.34）周，体质指数（BMI）（27.04±3.25）kg/m2。对照组年龄 25～36 岁，平均（29.84±4.26）岁，孕周（38.17±2.42）周，BMI（26.21±3.32）kg/m2，均为汉族，无糖尿病家族史和脂代谢异常史。研究组患者与对照组年龄、孕周等一般资料差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女BMI、血糖、血脂水平比较 研究组孕妇的BMI、0、1、2h血糖水平、血清HbA1c水平、甘油三酯浓度显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 1。

表1 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女BMI、血糖、血脂水平比较（mmol/L

表1 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女BMI、血糖、血脂水平比较（mmol/L

注：HbAlc：糖化血红蛋白；BMI：体质指数

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2.3 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女PAX4基因SNPs位点基因型和等位基因频率比较 所有研究对象PAX4基因rs10229583位点和rs114202595位点基因型均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05），见表2。PAX4基因rs10229583位点研究组研究对象G等位基因频率显著高于对照组（83.41%vs77.20%），G等位基因是妊娠期糖尿病的危险因素（OR=1.485，95%CI=0.983～2.244，χ2=3.907，P=0.048）。PAX4基因rs114202595位点研究组研究对象A等位基因频率显著高于对照组（8.05%vs3.60%），A等位基因是妊娠期糖尿病的危险因素（OR=2.344，95%CI=1.054～5.368，χ2=5.158，P=0.023）。

2.4 PAX4基因SNPs位点基因型与妊娠期糖尿病患者临床特征参数的相关性 结果显示，妊娠期糖尿病患者rs10229583位点和rs114202595位点各基因型之间的年龄、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等的差异无统计学意义（P＞0.05），即PAX4基因SNPs位点基因型与妊娠期糖尿病患者的年龄、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等参数之间无相关性，见表3、4。

表2 妊娠期糖尿病患者与健康妊娠妇女PAX4基因SNPs位点基因型和等位基因频率比较

表3 PAX4基因rs10229583位点SNP与GDM患者临床特征参数的相关性（mmol/L

表3 PAX4基因rs10229583位点SNP与GDM患者临床特征参数的相关性（mmol/L

注：BMI：体质指数；HbAlc：糖化血红蛋白；PAX4：配对盒 4；SNP：单核苷酸多态性；GDM：妊娠期糖尿病

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表4 PAX4基因rs114202595位点SNP与GDM患者临床生化特征的相关性（mmol/L

表4 PAX4基因rs114202595位点SNP与GDM患者临床生化特征的相关性（mmol/L

注：BMI：体质指数；HbAlc：糖化血红蛋白；PAX4：配对盒 4；SNP：单核苷酸多态性；GDM：妊娠期糖尿病

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3 讨论

GDM是由遗传、环境、免疫等多种因素引起的疾病，且GDM与T2DM具有相似的遗传背景。因此与T2DM相关的SNPs位点也成为了筛选与GDM相关性的靶点[9-10]。有研究显示，与T2DM相关的遗传性变异也与GDM有关[11]。胰岛特异性转录因子——PAX4基因编码一种转录因子，能够促进胚胎组织细胞的增殖、分化和存活[12]。为了研究PAX4基因单核苷酸多态性是否与GDM的发生具有相关性，本研究评估了PAX4基因的rs10229583位点和rs114202595位点SNPs与GDM的相关性。

本研究结果显示，GDM患者的BMI、血糖水平、HbA1c和甘油三酯浓度均显著高于正常对照组（P＜0.05），临床诊断GDM的孕妇需要接受饮食和运动治疗，必要情况下可以采用药物治疗以控制血糖水平。分析GDM患者组和正常妊娠组GDM基因的rs10229583位点和rs114202595位点基因型和等位基因频率结果发现，GDM患者的rs10229583位点G等位基因频率显著高于正常妊娠的孕妇，提示G等位基因是GDM的危险因素（OR=1.485，95%CI=0.983 ～2.244，χ2=3.907，P=0.048）。GDM 患 者 组rs114202595位点A等位基因频率显著高于对照组，说明A等位基因是GDM的危险因素（OR=2.344，95%CI=1.054～5.368，χ2=5.158，P=0.023）。有研究发现，rs10229583与T2DM的发生相关[13]。Ma等[14]研究显示，PAX4基因rs10229583位点SNPs与空腹血糖升高和β细胞功能的下降有关。另外，邓德耀等[15]研究显示，PAX4基因的rs114202595位点SNPs与云南省昆明地区T2DM患者胰岛β细胞功能进展性紊乱有关。PAX4是β细胞的关键调控者之一，缺乏PAX4的小鼠在产后几天死亡，它们由于缺乏成熟的胰岛β细胞而发展成严重的高血糖症[16]，PAX4基因rs10229583位点和rs114202595位点单核苷酸多态性可能影响PAX4的表达，进一步导致胰岛β细胞功能缺失，具体还需要进一步研究证实。

与此同时，本研究还分析了PAX4基因的rs10229583位点和rs114202595位点SNPs对患者临床症状参数的影响，结果显示，PAX4基因SNPs位点基因型与GDM患者的年龄、孕周、BMI、血糖水平、HbAlc、甘油三酯水平等参数之间无相关性。由于受到临床样本数量的限制，部分基因型研究对象数量相对较少，可能对统计分析结果的客观性具有一定的影响，还需要扩大样本量进一步研究。

综上所述，PAX4基因 rs10229583位点和rs114202595位点单核苷酸多态性与妊娠期糖尿病发病相关，需要进一步研究以明确其发病机制。