川芎嗪对肺癌顺铂耐药细胞A549/DDP凋亡的影响

来岳标 姚庆华

顺铂是肺癌化疗的基础药物，但是其有效率往往随着肿瘤细胞耐药性的产生而逐步降低，甚至无效，肿瘤细胞对顺铂的耐药严重影响了化疗疗效[1]。川芎嗪（tetramethypyrazine，TMP）是中药川芎的有效成分，具有抗血小板聚集、改善血流动力学、增强免疫力、清除氧自由基及改善纤维化等作用。已有研究证实，川芎嗪具有抗肿瘤生长、抗血管生成、抗细胞耐药、放疗增敏、抑制肿瘤细胞远处侵袭转移等作用，但对于川芎嗪逆转肿瘤细胞对化疗药物耐药性的研究尚处于起步阶段[2-3]。研究表明，川芎嗪能在细胞层面诱导多种肿瘤细胞的凋亡，但其对川芎嗪诱导凋亡的分子机制研究仍不够深入[4]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路对基因的表达及细胞质功能的正常发挥起着关键的作用，并广泛参与细胞凋亡，其信号通路的二级结构主要由应激活化蛋白激酶（JNK）、p38蛋白激酶、细胞外信号调节激酶（ERK）三个部分相互交叉连接组成[5]。本研究从分子水平探讨川芎嗪诱导顺铂耐药细胞株A549/DDP的凋亡机制。

1 实验材料

1.1 细胞培养 实验所用耐药细胞株A549/DDP由浙江省肿瘤医院实验室提供。肺腺癌A549/DDP细胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃且含5%CO2的培养箱中进行培养，1:4～1:5比率传代。

1.2 药 物 川芎嗪（四甲基吡嗪）注射液：规格80mg/支，批号20150552，由北京四环科宝制药有限公司生产。

1.3 试剂及仪器 RPMI-1640培养基（批号 30030）、胎牛血清（批号 11012）、缓冲液（批号 C0221A）、消化液（批号 C0201）、培养皿（批号 FCD101）等购于碧云天生物有限公司。显微镜（XSP-2C）、流式细胞仪（FACSCanto）、放射自显影仪（DC-400SL）等仪器由浙江省肿瘤医院实验室提供。

2 方法

2.1 MTT法测定不同浓度川芎嗪对A549/DDP细胞增殖抑制率的影响 细胞传代3次后收集A549/DDP细胞，洗涤沉淀后用培养基调整细胞浓度至7×104个/mL，用移液器将细胞悬液加至96孔板，每孔200μL。12h后显微镜下仔细观察并确认细胞贴壁后用培养基调整川芎嗪浓度（0.10、0.20、0.40、0.80、1.00mg/mL），将不同浓度TMP分别加入96孔板内继续培养孵育，空白对照组加入RPMI-1640培养基。在加入药物24h、48h、72h后分别加入20μL噻唑蓝（MTT）溶液终止细胞增殖，培养箱中继续孵育A549/DDP细胞4h后用移液器小心吸弃96孔板内的液体；二甲基亚砜150μL均匀加入96孔板后将其置于振荡器上缓慢匀速振荡10min。振荡结束后将96孔板置于酶标仪中及时测定每孔吸光值，将吸光值转换为A549/DDP细胞增殖抑制率。然后根据不同浓度川芎嗪所对应的A549/DDP细胞增殖抑制率绘制曲线图。每一浓度均设置6个平行对照孔，实验3次以上。

2.2 流式细胞法测定川芎嗪对肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的影响 取对数生长期的A549/DDP细胞每孔10×105个/mL接种于培养皿中，24h后实验组加入浓度为 0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1的川芎嗪，对照组不加药物。不同浓度川芎嗪加入后继续于培养箱中孵育72h后离心、洗涤、收集A549/DDP细胞。用培养基调整浓度为2×106/mL。各组取1mL细胞悬液后，在4℃、800rmp条件下离心12min，移弃上清液。PBS液提前预冷至4℃，将A549/DDP细胞洗涤3次后用培养基将细胞浓度调整至2×106个/mL。将细胞悬液移至流式管后加入细胞结合缓冲液，细胞悬液与细胞结合缓冲液充分接触后再加入细胞染色液后，将流式管放置于0℃避光条件下继续孵育15min。孵育结束后将流式管置于流式细胞仪内进行细胞凋亡相关数据采集并分析结果。

2.3 川芎嗪对肺腺癌A549/DDP细胞形态的影响取A549/DDP细胞每孔1×105个/mL接种于六孔板中，12h后确认细胞贴壁，实验组A549/DDP细胞用浓度为0.40mg/mL的川芎嗪处理72h进行干预，对照组加入等量培养基。72h后离心、洗涤、收集细胞后加入2.5%的戊二醛溶液中在4℃避光条件下固定4h，固定结束后用乙醇溶液进行细胞脱水处理，分别予丙酮及环氧树脂处理并包埋2h，将包埋后的标本放置于62℃烤箱中烘烤后结束后进行标本超薄切片处理；运用透射电子显微镜仔细观察细胞处理前后是否有形态学及凋亡征象的变化。通过观察细胞胞体大小、细胞质浓缩状态、细胞核染色质凝聚情况、细胞核膜、细胞质膜以及细胞器完整与否来判断耐药细胞A549/DDP的凋亡。每一浓度均设置6个平行对照孔，实验3次以上。

2.4 免疫印迹实验 取对数生长期的A549/DDP细胞，每孔20×105个/mL接种于培养皿中，不同浓度川芎嗪（0.2mg·mL-1、0.4mg·mL-1）处理 A549/DDP 细胞72h后离心、洗涤、收集细胞，用预冷的PBS液悬浮细胞后洗涤2遍，将洗涤干净后的细胞加入提前预冷的细胞裂解液中充分接触，对照组不加药物。对照组及不同浓度药物处理组均采用BCA进行蛋白浓度测定，并记录数据。采用10%凝胶跑电泳后分离、转膜。用TBST液体在常温下进行抗体封闭。洗膜后于4℃条件下孵育相对应的一抗（P-JNK，JNK，PP38，P38，P-ERK，ERK）12h，一抗稀释浓度均为 1：1000。12h后室温下漂洗3次后孵育二抗，化学发光显色剂涂匀后，于自显影仪中曝光并收集数据。

2.5 统计学方法 本实验均在相同实验条件下进行3次及以上实验。应用SPSS18.0统计软件进行分析。计量数据以均数±标准差（）表示，采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 川芎嗪抑制肺癌细胞A549/DDP的增殖 川芎嗪对A549/DDP细胞的增殖抑制率随着川芎嗪浓度的增加和作用时间的延长而逐渐增加，有时间和剂量依赖性（P＜0.05）。川芎嗪作用72h A549/DDP细胞在增殖抑制率上表现出明显的梯度，故后续实验均选用药物干预72h作为实验条件。见表1。

表1 不同浓度川芎嗪对肺癌A549/DDP细胞增殖抑制率的影响（%，）

表1 不同浓度川芎嗪对肺癌A549/DDP细胞增殖抑制率的影响（%，）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 24h 组比较，△P＜0.05；与 48h 组比较，▲P＜0.05；TMP：川芎嗪

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3.2 川芎嗪诱导肺癌细胞A549/DDP的凋亡 川芎嗪（0.20mg·mL-1、0.40mg·mL-1、0.80mg·mL-1）处理耐药细胞A549/DDP 72h后，细胞早期凋亡（AV+/PI-）比例随着川芎嗪浓度的增加而逐渐增加，并且存在浓度依赖性，见插页图1。

表2 MAPK信号通路蛋白表达灰度值比较（

表2 MAPK信号通路蛋白表达灰度值比较（

注：与对照组比较，*P＜0.05；与 TMP（0.20mg/mL）比较，△P＜0.05；TMP：川芎嗪；P-ERK：磷酸化细胞外信号调节激酶；ERK：细胞外信号调节激酶；P-JNK：磷酸化应激活化蛋白激酶；JNK：应激活化蛋白激酶；p38：蛋白激酶；P-p38：磷酸化p38蛋白激酶；Action：内参蛋白

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3.3 川芎嗪作用前后A549/DDP细胞形态变化 川芎嗪处理后A549/DDP细胞出现了典型的凋亡形态改变：细胞核凝聚，呈新月形；细胞体积缩小；细胞膜、质膜及细胞器不连续、完整性消失；胞质内可见数量不等、大小不一的空泡出现；典型的凋亡小体出现，见插页图2。

3.4 川芎嗪通过MAPK信号通路诱导A549/DDP细胞的凋亡 P-JNK及P-P38在川芎嗪处理后出现蛋白量表达量增加的趋势，而P-ERK出现表达降低的趋势；而非磷酸化表达的ERK、JNK、P38在蛋白水平无明显变化。通过Western blot检测表明，在MAPK信号通路中川芎嗪能通过抑制ERK的表达的同时增加JNK和P-38在蛋白水平的表达从而诱导耐药细胞株A549/DDP细胞的凋亡，见表2、插页图3。

4 讨论

细胞凋亡是生物体内基因控制的一种细胞死亡过程，其主要目的是通过细胞凋亡后将细胞凋亡产物进行重新利用，维持体内代谢的需要，是一种主动的损伤现象，是细胞为了适应环境的变化而主动死亡的一个过程，细胞凋亡对于肿瘤的产生及生长过程具有十分重要的意义[6-8]。

本研究显示，川芎嗪与细胞增殖率之间存在时间剂量依赖性（P＜0.05），川芎嗪作用72小时后A549/DDP细胞在增殖抑制率上表现出明显的梯度。V-PI染色法检测显示川芎嗪处理A519/DDP细胞后，早期凋亡率随着川芎嗪浓度的增加而逐渐增加，说明川芎嗪诱导的细胞凋亡是杀伤A549/DDP细胞的途径之一。电子显微镜观察可见川芎嗪0.40mg·mL-1处理后A549/DDP细胞细胞核凝聚，细胞体积缩小，细胞膜、质膜及细胞器不连续，完整性消失，胞质内可见数量不等、大小不一的空泡和典型的凋亡小体出现，直接证明了A549/DDP细胞的凋亡。

MAPK信号通路涉及多种生物学行为，具有将细胞表面的信息传递至核内进而影响基因转录的重要传递途径，对于肿瘤耐药细胞凋亡的产生发挥着重要的作用，主要由ERK、JNK和p38组成；ERK参与细胞的增殖、分化和增殖活性，JNK和p38激酶主要由细胞外刺激产生应答[15]。本实验表明，川芎嗪处理72小时后P-JNK及p-P38蛋白量表达增加且呈现出浓度依赖性，而p-ERK出现表达降低的趋势（P＜0.05）；而非磷酸化表达的 ERK、JNK、P-38在蛋白水平未见到有意义的变化。

综上所述，本研究观察到川芎嗪能引起顺铂耐药细胞株A549/DDP的增殖抑制及凋亡，表现出JNK及p-38在磷酸化水平的活化，说明川芎嗪能通过MAPK信号通路引起A549/DDP的凋亡。